научная статья по теме ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ESCHERICHIA COLI С РАСТЕНИЯМИ НА ПОПУЛЯЦИОННОМ И КЛЕТОЧНОМ УРОВНЯХ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ESCHERICHIA COLI С РАСТЕНИЯМИ НА ПОПУЛЯЦИОННОМ И КЛЕТОЧНОМ УРОВНЯХ»

УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2015, том 135, № 3, с. 297-306

УДК 635.1/.8:579.869.1

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ESCHERICHIA COLI С РАСТЕНИЯМИ НА ПОПУЛЯЦИОННОМ И КЛЕТОЧНОМ УРОВНЯХ

© 2015 г. В. И. Пушкарева Л. В. Диденко1, А. А. Овод2,

С. А. Ермолаева 1

1 Научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения РФ, Москва 2 Российский государственный аграрный университет им. К.А.Тимирязева Министерства сельского хозяйства РФ, Москва E- mail:VPushkareva@inbox.ru

Проблема бактериальных кишечных инфекций, в частности, инфекций, ассоциированных с энте-рогеморрагическими Escherichia coli (EHEC), носит глобальный характер и для своего решения требует комплексного подхода, включающего, в том числе, экспериментальные исследования в области экологии возбудителей. На моделях вегетирующих растений базилика Ocimum basilicum бактериологическими методами показано длительное существование многочисленных популяций токсин-продуцирующих E. coli O157:H7 внутри растительных тканей. Полимеразная цепная реакция подтвердила сохранение гена токсина stxl на протяжении опытов. На каллусах пекинской капусты Brassica rapa subsp. pekinensis и листового салата Lactuca sativa изучены стадии формирования биопленок E. coli. Методами световой и сканирующей электронной микроскопии выявлено, что бактериальные биопленки на поверхности каллусов после контаминации формируются чрезвычайно быстро (6-24 часа), обеспечивая жизнеспособность популяций возбудителей. Гистологические исследования инфицированных каллусов не выявили выраженного фитопатогенного воздействия на модельные растения. В статье обсуждается экстраполяция результатов лабораторных экспериментов в полевые условия с выявлением путей циркуляции патогенных эшерихий в агроценозе с точки зрения обеспечения пищевой безопасности населения.

Ключевые слова: Escherichia coli O157:H7, агрокультуры, каллусы, биопленки.

ВВЕДЕНИЕ

В эру антибиотиков кишечные инфекции бактериальной природы остаются глобальной проблемой не только в странах третьего мира, но и в государствах с высокотехнологичной пищевой индустрией. По данным всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) ежегодно в мире регистрируется около трети миллиарда диарейных заболеваний (World Health Organisation, 2012), причем лабораторно-подтвержденные вспышки эшери-хиоза (EHEC) постоянно встречаются в Европе, Северной Америке (от 1-2 случаев на 100 тыс. чел.), Аргентине (до 22 случаев на 100 тыс. чел.) (Европейское ..., 2012).

В России на фоне ежегодного устойчивого роста заболеваемости кишечными инфекциями (до 7%), вызванными установленными и неустановленными возбудителями, регистрируется от 17 до 20 тыс. случаев эшерихиозов, однако без

строгой дифференциации серовара (Онищенко, 2008). Заражение происходит алиментарным путем, в основном через мясные, молочные продукты, воду.

Растениям как фактору передачи инфекции отводится незначительная роль, хотя после эпидемии в Японии (более 10 тыс. чел.), вызванной проростками редиса, в мире зарегистрировано более 40 серьезных вспышек, причиной которых были овощи и салаты, не подвергавшиеся тепловой обработке. В 2011 году Европу охватила "зеленая эпидемия" (около 4 тыс. чел.), вызванная энтерогеморрагической Escherichia coli серовара 0104:H4, связанная с употреблением овощей, которая приобрела резонансный и даже панический характер, поскольку повлекла за собой более 50 смертей и осталась нерасшифрованной, с невыясненным резервуаром / источником возбудителя (Brandl, 2006, 2008; Brandl, Amundson, 2008; Европейское..., 2012).

Известно, что основными резервуарными хозяевами различных серовариантов энтеропатогенных кишечных палочек являются сельскохозяйственные животные (жвачные), в кишечнике которых они обитают в составе микробиоты, не нанося вреда взрослым животным. Существование бактерий во внешней среде традиционно рассматривается как кратковременное событие в отрыве от возможных симбиотических связей с микро- и макрофлорой, а также с протистофауной.

Детально изучены закономерности и механизмы существования патогенных микроорганизмов в почвенных и водных экосистемах лишь для возбудителей сапронозов: Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Pseudomonas spp. и ряда других (Литвин и др., 1998). Возбудители кишечных инфекций, не относящиеся к классу сапронозов, в том числе Escherichia coli, Salmonella enterica, Campylobacter и др., тем не менее, также постоянно выделяются из природных и урбанизированных экосистем: почвы, водоемов, бассейнов, субстратов агрокомплексов, прудов орошения, предприятий пищевой индустрии и пр. Существует множество публикаций, описывающих динамику их размножения на листовых салатах, проростках злаковых, бобовых, кинзе, капусте и др., однако при этом растения рассматриваются скорее как субстраты, чем как живые организмы, обладающие защитными механизмами, иммунитетом, способные инфицироваться несколькими путями (контаминация пророщенных семян, листьев, стеблей либо из ризосферы) и обладающие возможностью неоднозначного взаимодействия агрокультур с бактериями, не относящимися к фитопатогенам (Brandl, 2008; Brandl, Amundson, 2008; Dong et al., 2003; Heaton, Jones, 2008; Martinez, 2013; Tyler, Triplett, 2008).

Эшерихиозы человека, связанные с E.coli, продуцирующими веротоксины/шигатоксины (более 100 серогрупп) и способными убивать веро-клетки (Vero cells), равнозначно трактуются во всем мире - представляют глобальную проблему (Cooley et al., 2008). Гены, кодирующие продукцию токсинов, обозначаются как локус "стирания" энтероцитов (LEE), способных обусловить атаку и повреждение эпителиальных клеток (A/E - фактор, определяемый наличием еае-гена и в плазмиде вирулентности 60 MDa - ehx-гена). Шигатоксины I и II (stx1, stx2) ответственны за клинический результат инфекции - геморрагический колит либо гемолитико-уремический синдром (ГУС).

Экологические условия (абиотические и биотические) существования токсин-продуцирующих эшерихий в антропогенно-преобразованной среде

(поле, теплица, оранжерея) изучены фрагментарно, затрагивая лишь эпидемиологические аспекты проблемы. Формирование биопленки на поверхности растений не рассматривалось, кроме наших исследований на модели изогенных штаммов Listeria monocytogenes (Пушкарева и др., 2013).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах использованы: токсин - продуцирующий (VT1) штамм E. coli ATCC № 43890 (O157:H7) США, выделенный от человека (коллекция ВГНКИ) и К12, используемый в генно-инженерных исследованиях (коллекция лаборатории). Эшерихии культивировали на среде Эндо и сердечно-мозговом бульоне (BHI, Difco, США), либо в почвенной вытяжке, полученной из гуму-сированной иловато-болотной почвы (оз. Неро). Идентификацию и биохимические свойства изолятов из почвенной вытяжки, растительных тканей оценивали на тест-системах API-Е (Bio -Merieux, Франция). При сомнительных результатах посевов - с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), в нашей модификации, с парой праймеров ttc-gct-ctg-caa-tag-gta и ttc-ccc-agt-tca-atg-taa-gat, являющихся специфическими, направляющими амплификацию фрагмента гена шига-токсина 1 (stx1). Стерильные растения базилика (Ocimum basilicum) выращивали до ли-стообразования в цилиндрах, а каллусы разных видов капусты и листового салата на среде Му-расиге - Скуга в чашках Петри при влажности воздуха 70%, освещенности 5000 люкс в течение 30-45 суток. Масса посадочного инокулюма растительных клеток составляла 0.25 г. Следует отметить, что все образцы, как каллусы, так и вегетирующие растения срезали стерильно ex tempore для бактериологического анализа, а также для фиксации в экспериментах по изучению биопленок и гистологии тканей (биоматериал не подвергался консервации и хранению).

Для изучения формирования биопленки на каллусных культурах пробоподготовку наружно контаминированных образцов (106 м.к./г) осуществляли путем фиксации по Ito-Karnovsky с последующим напылением слоя золота или углерода толщиной 5 nm с помощью напылительной установки (SPI Inc, USA). Препараты анализировались методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) в микроскопе Quanta 200 3D (FEI Compani, USA).

Заражение вегетирующих растений и каллусов для бактериологических исследований проводили с помощью шприца, вводя бактериальную суспензию в агар под каждый образец, в зависимо-

сти от задачи опыта, в дозах от 105 до 107 м.к./мл. В качестве контроля оставляли растения и каллусы, под которые вводили по 1.0 мл изотонического раствора NaCl. Посевы исследовали в динамике (через 1-3-5-7 суток после заражения) путем высева суспензии из гомогенизированных в изотоническом растворе хлористого натрия образцов (Disperser T 10 basic IKA, Germany) на среду Эндо для количественного учета по колоние-образую-щим единицам (КОЕ). Перед измельчением каждый образец отмывали гентамицином (100 мкг/г) для элиминации наружных контаминантов.

Фиксация образцов осуществлялась в течение 3 суток при комнатной температуре в растворах уксусной кислоты и этилового спирта (95%) в соотношении 3:1, с последующей промывкой тканей в дистиллированной воде. Затем следовала проводка образцов через "батарею спиртов" от 70 до 96°С для обезвоживания. После обработки смолами и отвердителями образцы подвергались резке на микротоме Reichert-jung (Германия), после чего полученные срезы препарата помещались на предметное стекло и подсушивались в течение 5 мин.

Микроскопические исследования образцов проводили в проходящем свете с помощью микроскопа Axio Imager М1 (Zeiss, Германия) при максимальном увеличении х2000. Микрофотоснимки сделаны цифровой камерой AxioCam MRm и обработаны с использованием программы AxioVision.

В работе использовали по 7 каллусов для каждого варианта опыта, из которых были составлены визуальные ряды для просмотра биопленок и гистологические препараты (180 срезов). Для посевов использовали от трех до пяти проростков для получения 10 г биомассы на каждую точку посева (63 растения). За исключением 3-D микроскопии и гистологических исследований опыты повторяли троекратно.

Статистическая о

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»