БИОХИМИЯ, 2008, том 73, вып.. 8, с. 1101 - 1113
УДК 577.214
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФАКТОРОВ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ XPC—HR23B, XPA И RPA С ПОВРЕЖДЕННОЙ ДНК*
© 2008 г. Ю.С. Красикова1, 2, Н.И. Речкунова1, Е.А. Мальцева1, И.О. Петрусева1, В.Н. Сильников1, Т.С. Зацепин3, Т.С. Орецкая3, О.Д. Шерер4, О.И. Лаврик1, 2**
1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины
СО РАН, 630090 Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8; факс: (383)333-3677, электронная почта: lavrik@niboch.nsc.ru
2 Новосибирский государственный университет, 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, 2 3 Химический факультет, МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва 4 Department of Pharmalogical Sciences, SUNYStony Brook, New York 11794-3400, USA
Поступила в редакцию 20.12.07 После доработки 18.03.08
Исследовано взаимодействие белков, участвующих в процессе эксцизионной репарации нуклеотидов — фактора Xeroderma pigmentosum комплементационной группы С в комплексе с гомологом дрожжевого белка Rad23 (XPC—HR23B), репликативного белка А (RPA) и фактора Xeroderma pigmentosum комплементационной группы А (XPA) — с 48-мерными ДНК-дуплексами, моделирующими поврежденную ДНК. Показано, что все исследуемые белки демонстрируют незначительное предпочтение в связывании поврежденной ДНК по сравнению с нативным ДНК-дуплексом. RPA стимулирует образование комплексов XPC—HR23B с ДНК, при совместном присутствии ХРА и XPC—HR23B в реакционной смеси наблюдается синергизм во взаимодействии этих белков с ДНК. RPA образует ковалентные сшивки с ДНК, содержащими фотореакци-онноспособный остаток 5I-dUMP в одной цепи и повреждение в виде флуоресцеин-замещенного производного dUMP в противоположной цепи дуплекса, а также стимулирует образование ковалентных сшивок XPC—HR23B с ДНК. Следовательно, RPA может являться одним из основных регуляторов процесса эксци-зионной репарации нуклеотидов на различных его этапах. Полученные данные свидетельствуют в пользу модели кооперативного связывания белков, участвующих в формировании предрасщепляющего комплекса, с ДНК-дуплексами, несущими повреждения.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: факторы эксцизионной репарации нуклеотидов, фотоаффинная модификация, фо-тореакционноспособные олигонуклеотиды, комплексообразование.
Передача генетической информации в неискаженном виде необходима как для выживания отдельной клетки, так и для сохранения организма в целом. Однако целостность ДНК, являющейся основным носителем генетической ин-
Принятые сокращения: NER — эксцизионная репарация нуклеотидов (nucleotide excision repair); Flu-dUMP — 5-{3-[6-(карбоксиамидо-флуоресцеинил)амидокапромо-ил] аллил1}-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфат; 5I-dUMP — 5-йодо-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфат; RPA — реплика-тивный белок А; XPA — фактор Xeroderma pigmentosum комплементационной группы А; XPC—HR23B — фактор Xeroderma pigmentosum комплементационной группы С в комплексе с гомологом дрожжевого белка Rad23.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in press, BM 07-426, 00.00.2008.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
формации, постоянно находится под угрозой из-за огромного числа внешних и внутренних агентов, повреждающих ее структуру. Воздействие этих агентов может привести к накоплению большого числа повреждений в ДНК и появлению мутаций, что может стать причиной развития рака и других заболеваний. Живыми организмами в процессе эволюции было выработано несколько механизмов восстановления поврежденной ДНК. Одним из таких путей является система эксцизионной репарации нуклеотидов (nucleotide excision repair, NER). Характерной особенностью системы NER является способность удалять очень широкий спектр повреждений ДНК; в частности, этот путь репарации является основным в клетках млекопитающих для удаления объемных ДНК-аддуктов, возникающих под действием факторов окружа-
ющей среды, таких как УФ-облучение и химические канцерогены, либо в результате применения химиотерапевтических средств [1—4]. Мутации в генах участников системы NER обусловливают ряд наследственных заболеваний, таких как Xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome и Trichothiodystrophy [4]. Больные с синдромом Xeroderma pigmentosum проявляют высокую чувствительность к солнечному свету, и среди них наблюдается высокий процент заболеваемости раком кожи [5—7].
В клетках эукариот существует два пути NER: транскрипционно-зависимая репарация (TC-NER), которая восстанавливает цепи ДНК активно транскрибируемых генов, и глобальная геномная репарация (GG-NER), обеспечивающая восстановление ДНК в нетранскрибируе-мых частях генома [8]. Свыше 30 полипептидов участвует в NER на различных этапах работы этой системы, а именно: 1 — узнавание повреждения, 2 — раскручивание ДНК-дуплекса в области повреждения, 3 — расщепление поврежденной цепи ДНК с 3'- и 5'-сторон от повреждения, 4 — застраивание образовавшейся бреши и 5 — лигирование разрыва [1, 2, 9].
Основное различие путей NER проявляется на этапе узнавания повреждения. В случае тран-скрипционно-зависимой репарации узнавание повреждения происходит при взаимодействии с ним РНК-полимеразы II и остановке процесса транскрипции [10, 11]. На сегодняшний день нет полного понимания того, как происходит узнавание повреждений системой глобальной геномной репарации. Эванс и сотр. [12] была предложена модель, согласно которой первичное узнавание повреждения осуществляет фактор Xeroderma pigmentosum комплементационной группы С в комплексе с гомологом дрожжевого белка Rad23 (XPC—HR23B). Высказанное предположение подтвердилось в экспериментах с использованием клеточных экстрактов, обедненных белками системы NER [13]. В этих экспериментах было показано, что поврежденная ДНК, предварительно проинкубированная с XPC—HR23B, процессируется быстрее, чем пре-дынкубированная с комплексом фактора Xeroderma pigmentosum комплементационной группы А с репликативным белком А (XPA—RPA). Согласно модели, предложенной на основании этих данных, процесс глобальной геномной репарации осуществляется по механизму, в котором комплекс XPC—HR23B играет роль фактора, узнающего изменение конформации спирали ДНК, вызванное повреждением, и обеспечивающего последующее привлечение в формируемый комплекс репарационно/транскрипцион-ного фактора TFIIH. На следующем этапе про-
исходит раскручивание ДНК-дуплекса гелика-зами XPB и XPD из состава TFIIH, далее комплекс XPA— RPA идентифицирует химические модификации, и затем осуществляются этапы 3—5, описанные выше [12, 13]. Однако в системе NER, реконструированной in vitro из очищенных белков, были получены противоположные результаты — субстрат, предынкубированный с комплексом XPA—RPA, процессировался быстрее [14]. Исходя из этих данных, была предложена альтернативная модель работы NER, согласно которой первичное узнавание повреждения осуществляет комплекс XPA—RPA, который помогает посадке на ДНК факторов XPC—HR23B и TFIIH. Несмотря на интенсивные исследования процесса NER, однозначного объяснения противоречивости данных до сих пор не найдено, однако эти противоречия снимаются в рамках модели случайного кооперативного связывания [15, 16]. Согласно этой модели повреждение первоначально детектируется любым из трех белков (XPA, RPA или XPC—HR23B), обеспечивающих за счет кооперативных белок-белковых взаимодействий сборку на поврежденной ДНК четырехкомпонентного комплекса, включающего фактор TFIIH, который осуществляет кинетическую проверку специфичности образовавшегося комплекса.
Кроме неоднозначности в общей схеме процесса NER неясными остаются детали взаимодействия отдельных участников процесса с поврежденной ДНК. Ранее в нашей лаборатории была установлена возможность применения олигонуклеотидов, содержащих объемные фо-тореакционноспособные аналоги нуклеотидов, в качестве субстратов, узнаваемых системой NER. Оказалось, что объемные фотореакцион-носпособные аналоги нуклеотидов, введенные в ДНК-субстраты, узнаются и процессируются белками UvrABC бактериальной системы NER, а также системой NER человека [17, 18]. Использование фотореакционноспособных групп, имитирующих повреждения, дает возможность ковалентно фиксировать полипептиды, находящиеся в непосредственном контакте с фотоактивным повреждением в ДНК. Однако в этом случае остается нерешенным вопрос о том, какие из белковых факторов системы NER находятся в контакте с неповрежденной цепью ДНК в процессе узнавания повреждения. Для решения этой задачи были сконструированы ДНК-дуплексы, содержащие 5-IdUMP в неповрежденной цепи и остаток Flu-dUMP в качестве повреждения в противоположной цепи (рис.1). Выбор фотореакционноспособного аналога нуклеотида обусловлен предположением о его минимальном воздействии на структуру двой-
а
0
II
-О—Р—
1
о~
о
уЧн
н Л гн ? н
5-1сШМР
5-йодо-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфат
5'-р*-СТАТ ввСв АввС вАТТ АА6Т 3'-вАТА ССвС ТССв СТАА ТТСА
ДНК 1
5'-р*-СТАТ ввСв АввС вАТТ АА6Т Э'-(ЗАТА ССвС ТССв СТАА ТТСА
ДНК 2
5'-р*-СТАТ ввсв Абвс вАТТ АА6Т 3'-(5АТА ССвС ТССв СТАА ТТСА
днкз
5'-р*-СТАТ ввев Аввс влит ААвТ З'-вАТА ССвС ТССв СТАА ТТСА
ДНК 4
5'-р*-СТАТ ввсв Аввс вАТТ ААви 3'-вАТА ССвС ТССв СТАА ТТСА
ДНК 5
5' -р*-СТАТ ввсв Аввс вАТТ АА6Т З'-вАТА ССвС ТССв СТАА ТТСА
ДНК 6
5'-р*-СТАТ ввСв АбвС вАТТ АА6Т З'-вАТА ССвС ТССв СТАА ТТСА
рш-аимр
5-{3-[6-(карбоксиамидо-флуоресцеинил)амидо-капромоил]аллил}-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфат
Тввв СААС вУСА вввТ СТТС С6АА СвАС-З' АССС вТТв САвТ СССА вААв вСТТ вСТв-5'
ТвввСААС виСА вввТ СТТС С6АА СвАС-З' АСССаЕ;ТС САвТ СССА вААв вСТТ вСТв-5'
Тввв СААС виСА вввТ СТТС С6АА СвАС-З' АССС вЕТв САвТ СССА вААв вСТТ вСТв-5'
Тв6вСААС вТСА СввТ СТТС СвАА СвАС-З'
АССС САвТ СССА вААв вСТТ вСТв-Б'
А —
ТвввСААС вТСА вввТ СТТС С6АА С6АС-3'
АССС _ ЕТв САвТ СССА вААв вСТТ вСТв-5' А
и
Тввв~ААС вТСА вввТ СТТС С6АА СвАС-З'
АССС ЕТв САвТ СССА САА6 вСТТ вСТ6-5' в -
С
Тввв ААС вТСА ввви СТТС С6АА СвАС-З'
АССС САвТ СССА вААв вСТТ вСТв-5'
А—
ДНК 7
и=5-1сШМР
Е=Е1и-сШМР
Рис. 1. Структуры аналогов нуклеотидов (а) и последовательности использованных ДНК-дуплексов (б)
ной спирали ДНК. В данной работе было
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.