ментах на нейронах моллюска, используя методику двухмикроэлектродной фиксации потенциала. Ток /Adepol входит в семейство А-токов и отличается от IA, зарегистрированного в работе Пена и со-авт. [12], более высоким порогом активации.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Эксперименты проводили на изолированных нейронах виноградной улитки Helix pomatia с помощью метода двухмикроэлектродной фиксации потенциала. Клетки выделяли механически без предварительной обработки ганглия протеолитически-ми ферментами. Изолированную клетку помещали в рабочую камеру объемом 1 мл с проточным раствором Рингера. Микроэлектроды заполняли раствором цитрата калия (2М), сопротивление электродов составляло 12-14 МОм. В работе использовали микроэлектродный усилитель MEZ 7101 и усилитель фиксации потенциала CEZ 1100 фирмы "Nihon Kohden" (Япония). Потенциалы и токи регистрировали с помощью четерехканального самописца RJG4024. Мембранный потенциал фиксировали на уровне -60 мВ при изучении Са2+-токов или -50 мВ при изучении К+-токов. Потенциалоза-висимые Ca2+- и К+-токи регистрировали во время деполяризующих стимулов. Токи утечки измеряли во время соответствующих гиперполяризующих стимулов. При построении вольт-амперных характеристик (ВАХ) токи утечки вычитали. Состав контрольного раствора при измерении К+-тока был следующим (в мМ): NaCl 100, KCl 4, CaCl2 5, MgCl2 4, NaHCO3 3, трис-HCl 5 (pH 7.6). При измерении Са2+-тока использовали безнатриевый раствор, содержащий антагонисты К+-каналов: бромид тетраэтиламмония (ТЕА) и 4-аминопиридин (4-АП). Состав этого раствора был следующим (в мМ): KCl 4, CaCl2 10, MgCl2 4, ТЕА 95, 4-АП 5, трис-HCl 5 (pH 7.6). Для приготовления раствора галантамина использовали таблетки Reminyl (аптечный препарат, фирма "Janssen-Cilag", Швейцария), содержащие 5.127 мг галантамина гидробромида. Полученный раствор фильтровали с использованием фильтра с диаметром пор 0.45 мкм ("Schleicher and Schul", Германия). Раствор галантамина добавляли в нужной концентрации в рабочую камеру при перекрытом протоке.
Статистический анализ результатов проводили с помощью программы Prism 3.0 (GraphPad). Статистическую значимость результатов оценивали с помощью непарного t-теста.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние галантамина на потенциалозависи-мый Са2+-ток. Высокопороговый Ca^-ток (ICa) регистрировали в безнатриевом растворе, содержащем блокаторы К+-каналов в высоких концентрациях. Этот ток активировали деполяризующими
тест-стимулами длительностью 150-500 мс от удерживаемого потенциала, равного -60 мВ. Тест-стимулы деполяризовали мембрану до величин, лежащих в интервале от -30 до +100 мВ, с шагом в 10 мВ. Максимальный ICa обычно регистрировали при потенциале +30 мВ. Внеклеточная аппликация галантамина в концентрациях 1-1000 мкМ вызывала быстрое, обратимое при отмывании и дозоза-висимое уменьшение амплитуды ICa (n = 7/7). Эффект достигал максимума через 2-4 мин после аппликации препарата и был полностью обратим при отмывании через 6-10 мин.
На рис. 1а представлены ВАХ, построенные по пиковому значению входящего тока (ICa) одной из клеток в контрольном растворе и в присутствии 50 и 500 мкМ галантамина. Можно видеть, что галан-тамин вызывает одинаковое уменьшение амплитуды ICa при всех потенциалах тест-стимула. На рис. 1б показаны записи максимального ICa этой же клетки, которые свидетельствуют об отсутствии заметного влияния галантамина на кинетику активации и инактивации тока. Дозозависимость ингиби-рующего влияния галантамина на ICa представлена на рис. 1e (n = 7). Среднее значение максимальной амплитуды ICa в присутствии 50 мкМ галантамина составило 0.85 ± 0.06 от контрольной величины и не отличалось достоверно от нее (P > 0.05), в то время как в присутствии 500 мкМ галантамина средняя величина максимального ICa составила 0.53 ± 0.12 и была достоверно ниже контрольного тока (P < 0.01). Положение экспериментальных точек близко к теоретической кривой (сплошная линия), построенной по уравнению Хилла для полного блока, где IC 50 = 515 ± 170 мкМ, а коэффициент Хилла H = 0.83 ± 0.27.
Три типа высокопорогового калиевого тока в нейронах моллюска. Для регистрации высокопорогового К+-тока удерживаемый потенциал устанавливали на уровне -50 мВ и предъявляли деполяризующие тест-стимулы, которые смещали мембранный потенциал до величин от -30 до +100 мВ с шагом в 10 мВ. Порог активации К+-тока находился вблизи -20 мВ. На разных клетках К+-ток различался по кинетике активации/инактивации, форме ВАХ и чувствительности к антагонистам. В одной группе клеток К+-ток имел медленную кинетику, почти полностью блокировался 1 мМ ТЕА, был нечувствителен к 1 мМ 4-АП, и его ВАХ имела N-образную форму (рис. 2). В бескальциевом растворе ВАХ теряла N-образную форму и становилась гладкой, что свидетельствует о присутствии не только Ca2+-независимого (IDR), но и Ca^^B^ симого компонента (Ic) в этом К+-токе. В другой группе клеток К+-ток имел быструю кинетику активации/инактивации, угнетался в присутствии 1 мМ 4-АП, но не 1 мМ ТЕА, и его ВАХ имела гладкий вид (IAdepol) (рис. 3). Наши результаты соответствуют опубликованным данным, которые свидетельствуют о присутствии Ic, IDR и IAdepol в вы-
V, мВ -20 0
20
40
- Контроль -Галантамин, 50 мкМ -Галантамин, 500 мкМ
60
--10
-20
--30 ^ нА
1/10 1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
10 100 1000 Галантамин, мкМ
30 мВ
-60 мВ
Контроль
Галантамин, Отмыв 50 мкМ
УТ
Галантамин, 500 мкМ
Отмыв
20 нА
500 мс
Рис. 1. Действие галантамина на высокопороговый Са2+-ток (/са). Контрольный раствор содержал 100 мМ ТЕА + 5 мМ 4-АП. а - Вольт-амперные характеристики, построенные по пиковым значениям входящего тока одной клетки. б - Записи тока, сделанные при потенциале тест-стимула длительностью 500 мс, смещавшего мембранный потенциал от -60 до 30 мВ. Та же клетка, что и на рис. 1а. Слева от записей тока показано соответствующее изменение потенциала. в -Зависимость доза-эффект, построенная по пиковым значениям входящего тока при потенциале тест-стимула 30 мВ. Сплошная линия - теоретическая кривая, построенная по уравнению Хилла для полного блока.
а
0
сокопороговом К+-токе нейронов моллюска [1719].
Полная блокада галантамином К+-тока с медленной кинетикой (1С и 1ок). На рис. 2а приведена ВАХ К+-тока с медленной кинетикой (1С+/ш) одной из клеток в контрольном растворе и в присутствии 50 и 500 мкМ галантамина. Контрольная кривая имеет ^образную форму с "горбом" с максимумом при потенциале 30 мВ. Этот "горб" обусловлен активацией Са2+-зависимого К+-тока (/с). При потенциалах от 80 до 100 мВ регистрируется в чистом виде Са2+-независимый К+-ток (/ш). Можно видеть, что галантамин сильнее подавляет ток при 30 мВ (/с), чем при 100 мВ (/ш). На рис. 26 представлена запись тока, активированного стимулами, деполяризующими мембрану до 30 мВ (верхняя строчка) и до 100 мВ (нижняя строчка) этой же клетки. Длительность этих стимулов составляла соответственно 500 и 150 мс. Мы намеренно уменьшили длительность высокоамплитудного стимула во избежание повреждения мембраны. Запись токов показывает, что в присутствии галантамина уменьшение пиковой амплитуды не сопровождается изменением кинетики активации и инактивации тока. На рис. 2в показаны усредненные графики дозозависимости блокирующего эффекта галантамина для 1с (30 мВ) и 1Ш (100 мВ) (п = 8). В присутствии 50 и 500 мкМ галантамина
средние значения тока, измеренного при 30 мВ (1с), составляли 0.62 ± 0.05 и 0.31 ± 0.06 (Р < 0.001) соответственно, а измеренного при 100 мВ (/ш) - 0.75 ± ± 0.06 и 0.40 ± 0.12 (Р < 0.05). Положение экспериментальных точек близко к теоретическим кривым, построенным по уравнению Хилла для полного блока. Анализ кривой, описывающей эффект блокады /с, показывает значения 1С50 = 109 ± ± 36 мкМ и Н = 0.6 ± 0.1. соответствующие значения для эффекта блокады /ш составляют: /С50 = = 237 ± 94 мкМ и Н = 0.6 ± 0.2.
Неполный блок галантамином высокопорогового К+-тока с быстрой кинетикой (1Ааеро). На рис. 3а показана ВАХ пиковой амплитуды К+-тока с быстрой кинетикой одной из клеток в контрольном растворе и в присутствии 50 и 500 мкМ галантамина. Можно видеть, что галантамин в одинаковой степени угнетает ток при всех потенциалах тест-стимула. На рис. 36 приведена запись выходящего тока этой же клетки, активированного тест-стимулом длительностью 500 мс и сдвигающего потенциал мембраны до 30 мВ. На записях тока видно, что уменьшение амплитуды не сопровождается изменением кинетики активации или инактивации. На рис. 3в представлен усредненный график дозозависимости блокирующего эффекта галантамина для /Айеро1, зарегистрированного при 30 мВ (п = 6). В присутствии 50 и 500 мкМ галанта-
'с + DR' нА
150 г
120 90 60 30 0
Контроль
ГалаитамиН' 50 мкМ Галантамин, 500 мкМ
I/I0 1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
• 30 мВ А 100 мВ
-20 0 20 40 60
80 100
У, мВ
10
100
1000 10000 Галантамин, мкМ
30 мВ
-50 мВ
100 мВ
_Л
п
л
50 нА
500 мс
-50 мВ
Контроль Галантамин, Отмыв Галантамин, Отмыв 50 мкМ 500 мкМ
Рис. 2. Действие галантамина на К+-ток с медленной инактивацией (Ic + dr). а - Вольт-амперные характеристики, построенные по пиковым значениям выходящего тока одной клетки. б - Записи тока, сделанные при двух разных потенциалах тест-стимула: во время стимула длительностью 500 мс, смещавшего мембранный потенциал от -50 до 30 мВ (верхний ряд), и во время стимула длительностью 150 мс, смещавшего мембранный потенциал от -50 до 100 мВ (нижний ряд). Та же клетка, что и на рис. 2а. Слева от записей тока показано изменение потенциала. в - Зависимости доза-эффект, построенные по пиковым значениям выходящего тока при потенциале тест-стимула 30 и 100 мВ. Сплошные линии -теоретические кривые, построенные по уравнению Хилла для полного блока.
а
мина средние значения пикового IAdepol составили 0.81 ± 0.04 (P < 0.05) и 0.40 ± 0.04 (P < 0.001) соответственно. В отличие от медленного К+-тока, блокада IAdepol галантамином была неполной, и даже при высоких концентрациях препарата (5001000 мкМ) эффект блокады составлял лишь 60 ± ± 5%. Экспериментальные точки совпадают с теоретической кривой, построенной по уравнению Хилла для неполного б
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.