ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 3, с. 370-376
_ ГЕНЕТИКА _
РАСТЕНИЙ
УДК 575.162:581.4
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГЕНА BRACTEA С ГЕНАМИ TERMINAL FLOWER1, LEAFY И APETALA1 ПРИ ФОРМИРОВАНИИ СОЦВЕТИЯ И ЦВЕТКА У Arabidopsis thaliana
© 2007 г. А. А. Пенин, Р. А. Будаев, Т. А. Ежова
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра генетики, Москва 119992;
e-mail: alekseypenin@gmail.com Поступила в редакцию 07.06.2006 г.
Основными генами, контролирующими архитектуру побега у Arabidopsis thaliana, являются TERMINAL FLOWER1 (TFL1), APETALA1 (AP1) и LEAFY (LFY). Ген BRACTEA (BRA) также является одним из ключевых регуляторов, определяющих развитие структуры соцветия. Проведен анализ морфологии двойных мутантов bra tfl1-11, bra lfy-5 и bra ap1-20, а также анализ экспрессии генов TFL1, AP1 и LFY у мутанта bra и растений дикого типа. Показано, что после инициации цветения ген BRA позитивно регулирует гены TFL1 и AP1, обеспечивая более 70% уровня экспрессии этих генов. Во фло-ральной меристеме ген BRA препятствует экспрессии гена AP1, ограничивая область его экспрессии зоной околоцветника. Полное превращение цветков в вегетативный побег у двойного мутанта bra lfy-5 свидетельствует о том, что ген BRA частично дублирует функции гена LFY в процессе инициации цветения, действуя независимо от него. В результате проведенных исследований показано, что ген BRA является одним из генов, определяющих баланс между поддержанием пролиферативной активности апикальной меристемы и развитием цветков в ее периферической части, который необходим для развития открытого типа соцветия у A. thaliana.
Как и подавляющее большинство видов семейства крестоцветных, Arabidopsis thaliana (L.) Hey-nh. формирует соцветие в виде открытой кисти. Развитие соцветия такого типа может происходить только в том случае, если на периферии апикальной меристемы (АМ) побега наблюдается достаточный для формирования цветков уровень активности генов флорального морфогенеза, а их активность в центральной части AM подавлена, что необходимо для поддержания ее пролиферативной активности.
При нарушении функционирования гена BRACTEA (BRA) происходит развитие соцветия в виде закрытой кисти [1, 2]. Кроме этого, у мутанта bra наблюдаются комплексные нарушения структуры цветка - недоразвитие лепестков, перегородки и столбика пестика [2]. Таким образом, исходя из фенотипа мутанта можно сделать предположение, что ген участвует в поддержании пролиферативной активности апикальной меристемы побега и принимает участие в развитии цветка. Кроме этого, ген участвует в супрессии развития брактей [1, 2], но рассмотрение генетического контроля этого признака выходит за рамки данного исследования.
Гены APETALA1 (AP1), TERMINAL FLOWER1 (TFL1) и LEAFY (LFY) - основные гены, определяющие структуру соцветия и цветка у A. thaliana [3]. У мутантов по гену TFL1, контролирующему поддержание пролиферативной активности AM,
так же как у мутанта bra, происходит развитие терминального цветка. Растения, у которых нарушены функции гена LFY или AP1, формируют цветки с признаками, характерными для побегов: у мутантов по гену AP1 вместо органов околоцветника развиваются листья, в пазухах которых формируются цветки второго порядка [4]; у мутантов lfy цветки базальной части соцветия заменены на побеги, а цветки на верхушке соцветия характеризуются спиральным расположением органов околоцветника, редукцией части лепестков и тычинок [5]. Для того, чтобы оценить относительный вклад гена BRA в поддержании пролиферативной активности AM и развитии цветка, был проведен анализ его взаимодействия с генами TFL1, LFY и AP1 путем сравнительного анализа фенотипов одиночных и двойных мутантов, а также изучения их экспрессии в растениях дикого типа и мутанте bra.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе были использованы: мутанты bractea (bra) и ap1-20 (аллель со средней экспрессивностью мутантного признака) из коллекции кафедры генетики МГУ им. М.В. Ломоносова; мутанты tfl1-11 (аллель с сильной экспрессивностью му-тантного признака), lfy-5 (аллель со слабой экспрессивностью мутантного признака); линия, содержащая конститутивно-экспрессирующийся ген AP1 под контролем промотора 35S РНК виру-
1/1
1/2
1/4
1/8
Количество продукта, нг
33 450 -
150 -
30
32
34
36
35 37 Циклы
Рис. 1. Скорость накопления продукта ПЦР при изменении исходного количества мРНК. Приведены результаты для неразбавленной (1/1) матрицы, разбавленной в 2 (1/2), 4 (1/4) и 8 (1/8) раз; а - гели на стадии линейного роста количества продукта ПЦР (под дорожками - номера циклов, на которых был произведен отбор проб); б - графики, отражающие скорость накопления продукта ПЦР, построенные на основании измерения количества продукта реакции.
са мозаики цветной капусты; линии CS6297 и CS8848, несущие слитые гены LFY::GUS и AP1::GUS соответственно из Центра биоресурсов A. thaliana при университете штата Огайо (Arabi-dopsis Biological Resource Center at Ohio State -ABRC). Мутантные растения bra, несущие в геноме слитые гены LFY::GUS и AP1::GUS, отбирали в F3- и F4-поколенияx от скрещиваний растений, гетерозиготных по мутации bra, с растениями линий CS6297 и CS8848.
Растения выращивали при температуре 20-25°C, относительной влажности 80%, при длинном (16 ч) и коротком (8 ч) световом дне. Анализ структуры цветков проводили с помощью сканирующей электронной микроскопии. Подготовку материала проводили по описанной ранее методике [6]. Расположение органов в цветках анализировали методом диаграмм [7]. Уровень транскрипции репортерных генов оценивали по ранее описанной методике [8].
Анализ уровня экспрессии генов AP1 и TFL1 проводили с помощью полуколичественной ПЦР продуктов обратной транскрипции (по [9] с модификациями). Концентрацию мРНК в пробах выравнивали с помощью анализа количества мРНК конститутивно-экспрессирующегося гена APT1 (аденинрибозилфосфотрансфераза 1) [10]. Концентрация мРНК в пробах считалась одинаковой, если количество продукта ПЦР с праймерами к гену APT1 в этих пробах на стадии линейного роста реакции достигало одинаковых значений на протяжении не менее четырех циклов, т.е. графики, отражающие рост количества продукта на этом участке, совпадали.
Разницу в количестве мРНК исследуемых генов вычисляли, исходя из разницы между графиками, отражающими рост продукта. Контрольный эксперимент показал, что при изменении исходной концентрации матрицы в 2 раза сдвиг графиков происходит на 1.5 цикла (рис. 1). Таким образом, отношение количества мРНК в пробах
(C2-C1)/1.5
вычисляли по формуле N1/N2 = 2 , где N1,
N2 - исходное количество мРНК в пробах 1 и 2, С1 и С2 - номера циклов, при которых количество продукта ПЦР одинаково на стадии линейного роста.
При несовпадении графиков, отражающих рост продукта для контрольного гена, при вычислении разницы в количестве исследуемых генов вводилась поправка по формуле, приведенной выше. Анализировали только пробы с исходным количеством матрицы, различающимся не более чем в 2 раза.
Программа для проведения ПЦР: 93°C - 2'30'', 1 раз; 93°C - 20'', 54°C - 30'', 72°C - 1'20", 18 раз; 93°C - 20'', 54°C - 30'', 72°C - 1'20'', 2 x 10 раз. Для построения графика насыщения ПЦР пробы отбирали через каждые два цикла, начиная с 18-го цикла. Количество продукта оценивали по интенсивности флуоресценции в агарозном геле. Использованные праймеры: к гену APT1: OLLY23, 5'-tcccagaatcgctaagattgcc-3', OLLY42, 5'-cctttccct-taagctctg-3' [10]; к гену AP1: AP1-F, 5'-tacagaccac-ccatgttgag-3'; AP1-R 5'-ttgaacgctatgagaggtac-3'; к гену TFL1: TFL1-F, 5'-gtgcagcggtttctctttgt-3', TFL1-R, 5'-cagatccttcttcactttggtg-3'.
Морфометрия мутантов bra, tfl1 и bra tfl1-11
Фенотип Число розеточных листьев Число вегетативных узлов цветоноса Число генеративных узлов цветоноса
16 ч 8 ч 16 ч 8 ч 16 ч 8 ч
bra bra tfl1-11 tfl1-11 6.9 ± 1.2 7.1 ± 1.4 9.9 ± 2.1 7.5 ± 0.9 7.4 ± 1.1 18.4 ± 2.3 1.8 ± 0.3 0.9 ± 0.2 1.6 ± 0.5 1.9 ± 0.8 1.3 ± 0.4 2.1 ± 0.9 7.0 ± 2.3* 0.7 ± 0.2* 2.5 ± 0.6* 7.6 ± 3.1* 2.4 ± 0.7* 21.1 ± 4.5
* Не считая терминальной группы или цветка.
Для оценки динамики изменения уровня экспрессии генов в ходе онтогенеза измерения проводили у растений разных биологических возрастов: до инициации цветения (выделение РНК проводили из растений на стадии розетки), после инициации цветения (выделение РНК проводили из розетки и цветоноса высотой от 2 до 10 мм), в момент зацветания первого цветка (выделение РНК проводили из молодых цветоносов). Для гена АР1 так же проводили оценку уровня экспрессии в цветках (выделение РНК проводили из соцветия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Взаимодействие генов BRACTEA и TERMINAL FLOWER 1
Для изучения взаимодействия генов BRA и TFL1 при поддержании пролиферативной активности АМ соцветия было проведено исследование двойного мутанта bra tfl1-11. Так как структура соцветия одиночных и двойного мутантов зависит от длины дня [2, 11, 12], морфометрия проводилась в условиях длинного и короткого дня (таблица). Вне зависимости от условий выращивания количество генеративных узлов цветоноса, которые образуются до формирования терминального цветка, у двойного мутанта существенно меньше, чем у одиночных (особенно в условиях короткого дня). Таким образом, прекращение активности АМ соцветия у двойного мутанта bra tfl1-11 ускорено по сравнению с одиночными мутантами, что свидетельствует об участии обоих генов (BRA и TFL1) в поддержании пролиферативной активности АМ соцветия в растениях дикого типа.
Сравнение уровня экспрессии гена TFL1 в растениях bra и дикого типа показало, что у мутанта наблюдается снижение уровня экспрессии TFL1, особенно заметное после инициации цветения (рис. 2,а-в). Из этого следует, что ген BRA положительно регулирует экспрессию TFL1, обеспечивая примерно 70% транскрипции этого гена (рис. 2,д). У двойного мутанта происходит потеря оставшихся 30% активности TFL1 по сравнению с
одиночным мутантом bra, что и приводит к ускорению формирования терминального цветка.
Взаимодействие генов BRACTEA и LEAFY
Для анализа взаимодействия генов BRA и LFY в развитии цветка был использован аллель lfy-5 со слабой экспрессивность
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.