ГЕНЕТИКА, 2010, том 46, № 3, с. 373-382
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ ^
УДК 575.16:582.683.2
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГЕНОВ ABRUPTUS/PINOID И APETALA1 В РЕГУЛЯЦИИ РАЗВИТИЯ ЦВЕТОНОСА Arabidopsis thaliana
© 2010 г. У. Н. Кавай-оол1, О. Ю. Карпенко2, Т. А. Ежова2
1Тувинский государственный университет, кафедра общей биологии, Кызыл 667000;
e-mail: dr.urana@mail.ru;
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991 2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра генетики, Москва 119992;
e-mail: ezhova2001@mail.ru Поступила в редакцию 03.07.2009 г.
Приведены результаты анализа морфологии растений одиночных мутантов abr и ap1-1, двойного мутанта abr ap1-1 и растений мутанта abr с эктопической экспрессией гена АР1 под контролем конститутивного промотора 35S рибосомной РНК вируса мозаики цветной капусты (abr 35S::AP1), а также результаты изучения уровня экспрессии гена AP1 в растениях дикого типа и мутанта abr. Установлено, что при определении времени перехода на репродуктивную стадию и идентичности фло-ральной меристемы ген ABR взаимодействует с геном АР1 по типу доминантного эпистаза. На основании обнаруженного в растениях мутанта abr увеличения уровня транскрипции АР1 и расширения зон транскрипции в листьях и внутренних мутовках цветка предполагается, что ген ABR опосредованно участвует в ограничении уровня и пространства транскрипции АР1. При развитии органов цветка наблюдается комплементарное взаимодействие доминантных аллелей, свидетельствующее о совместном участии генов в этом процессе.
Развитие цветка контролируется сложной системой взаимодействующих генов и физиологических факторов. Важную роль в инициации развития меристемы цветка играет ген ABRUPTUS/PINOID1 (ABR/PID1), регулирующий полярный транспорт ауксина (ПТА). Ген ABR/PID1 кодирует серин-треониновую проте-инкиназу, которая участвует в обеспечении локализации на мембране клетки белка PIN1, выносящего ауксин из клетки [1—3]. Мутации в гене ABR/PID1 приводят к нарушению ПТА в растениях [4—7] и ряду морфологических особенностей — формированию цветоноса, который имеет булав-ковидное окончание и на котором либо нет цветков, либо развиваются немногочисленные цветки аномальной морфологии [1, 4, 7, 8]. Фенотип мутанта свидетельствует о важной роли ПТА в контроле морфогенеза цветка как на самых ранних этапах детерминации и развития флоральной меристемы (ФМ), так и при образовании флораль-ных органов.
Ранее было выявлено нарушение паттерна экспрессии регуляторного гена LEAFY (LFY), детерминирующего развитие меристемы цветка в растениях мутанта pin1 [9], и существенное (100-кратное) снижение уровня экспрессии этого гена в растениях мутанта abr [10]. Наряду с геном LFY важную роль в детерминации меристемы цветка играет ген APETALA1 (АР1), продуктом которого является транскрипционный фактор, содержа-
щий высококонсервативный ДНК-связывающий MADS-домен [11]. Нарушение функции гена AP1 приводит к задержке развития ФМ и сохранению у цветка признаков побега: из пазух наружных флоральных органов, представленных у мутантов ар1 не чашелистиками, а листоподобными органами (брактеями), развиваются цветки второго порядка, которые могут образовывать новые дополнительные цветки [12, 13]. Влияние гена на развитие ФМ связано с транскрипционной активацией гена LFY и репрессией его антагониста — гена TERMINAL FLOWER1, поддерживающего недетерминированность побеговой меристемы [14]. Кроме того, ген АР1 подавляет транскрипцию генов, контролирующих время цветения: SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP), AGAMOUS-LIKE 24 (AGL24) и SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1 (SOC1). Превращение цветков мутантов ар1 в побегоподобные структуры во многом связано с их эктопической экспрессией в растениях [15]. Поскольку у мутантов ар1 вместо чашелистиков развиваются брактеи, а лепестки не развиваются, гену АР1 приписывается также функция детерминации органов околоцветника (чашелистиков и лепестков), которую он выполняет вместе с геномAP2 [13].
Проведенный ранее анализ двойного мутанта abr ap1-1 показал, что ген ABR взаимодействует с геном АР1. При температуре 25—29°С наблюдали эпистаз ABR над АР1 (двойные мутанты abr ap1-1
формировали булавковидные цветоносы, полностью лишенные цветков), а при 20—24°С — комплементарное взаимодействие генов при развитии цветков. В отличие от цветков abr, цветки abr ap1-1 были лишены околоцветника, а в отличие от ар1-1 — не имели признаков вегетативных побегов [8]. Сложность трактовки фенотипа двойного мутанта при разных условиях выращивания потребовала проведения дополнительных исследований характера взаимодействия генов ар1-1 и abr. В данной работе приведены результаты сравнительного анализа морфологии растений с разным уровнем активности генов АР1 и ABR и результаты изучения уровня экспрессии гена AP1 в растениях дикого типа и мутанта abr.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал и условия выращивания. В работе использовали растения мутанта abr (линия К-150) и расы дикого типа Dijon-M (К-1) из коллекции кафедры генетики МГУ им. М.В. Ломоносова, а также растения мутанта ap1-1 из линии mm1R, которые 3 раза скрещивали с растениями линии К-1 для создания однородного генетического фона. Растения выращивали в условиях теплицы и на агаризованной среде Квитко в лабораторных установках. Семена линий, содержащих слитые гены 35S::AP1 и AP1::GUS (CZ 8848), получены из коллекции Arabidopsis Biological Resource Centre (http://arabidopsis.org/abrc/). Двойные мутанты abr ap1-1 выделяли среди растений в поколениях F2 и F3 от скрещиваний мутанта abr с растениями ap1-1. Мутантные растения abr, содержащие в геноме конструкции 35S::AP1 и AP1::GUS, отбирали среди растений в поколениях F2 и F3 от скрещиваний мутантов abr с растениями 35S::AP1 и AP1::GUS, соответственно.
Морфометрия. Описания проводили на 5-дневных проростках и растениях 4—9-недель-ного возрастов на выборке из 25 растений. Измеряли количество семядольных и розеточных листьев, общую высоту, число вегетативных и генеративных узлов на главном цветоносе. Для цветков использовали критерии, принятые ранее для A. thaliana [13]. Среднее число органов цветка и число дополнительных цветков рассчитывали для 10 цветков, базально расположенных на главном цветоносе (с 1-го по 10-й цветки). Съемки растений проводили цифровыми фотоаппаратами фирм "Minolta" (USA) и "Casio" QV-4000 (Japan).
Сканирующее электронное микроскопирование. Исследование органов и тканей растений проводили с помощью аналитического сканирующего электронного микроскопа JSM-6380LA (Jeol, Japan) и СЭМ S-405A ("Hitachi", Japan). Материал фиксировали в 4%-ном глутаральдегиде в 0.025 М фосфатном буфере (рН 7.0) при 4°С в течение
18 ч. Затем образцы опускали в 2%-ный осмий (0s04) (на ночь), три раза промывали фосфатным буфером, обезвоживали серией спиртов возрастающей концентрации (30, 50, 70% не более 10— 15 мин и 80 и 96% по 2 раза 30 мин) и переносили далее в 100%-ный ацетон на 30 мин. Материал проводили через critical point dry. Структуры прикрепляли к столикам и напыляли смесью палладия и платины в ионном напылителе IB-3 (Eiko, Japan) слоем 15 нм.
Анализ транскрипции гена АР1. Уровень транскрипции АР1 оценивали с помощью метода ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) и изучения экспрессии репортерного гена ß-глюкуронидазы (GUS) под контролем промотора гена AP1 (AP1::GUS). Активность ß-глюкуронидазы определяли по методу [16], используя в качестве субстрата X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-glu-curonic acid-cicloinoxilammonium salt) ("Duchefa") в концентрации 1 мМ. При фотографировании объектов использовали бинокуляр МБС-10 и компьютерную программу Image Scope.
Для выделения РНК применялся RNA Easy KIT фирмы QIAGEN с дополнительной обработкой ДНКазой с помощью RNase-Free DNase Set ("Qiagen", Germany). Обратную транскрипцию проводили с использованием набора cDNA Synthesis Kit (first strand) с 15T праймером ("Silex", Russia). ПЦР-РВ проводили на приборе AHK-32 ("Syntol", Russia), с использованием наборов "Комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии EVA Green" ("Syntol", Russia). В качестве внутреннего контроля использовали ген EF1 (фактор элонгации), который характеризуется конститутивной экспрессией в растениях A. thaliana [17]. Для амплификации кДНК использовали следующие праймеры: для АР1CATCTTCTTGATACAGACCACCCAT и GTATAACAGGCTTAAGGCTAAGATTGAG, а для EF1 TTGCTGTTGTAACAAGTGGATGC и AAGATTGGTGGTATTGGAACGG. Анализ проводили в трех повторностях.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Особенности морфологии побега и цветка растений
с разным уровнем активности генов ABR и АР1
У двойного мутанта abr ap1-1, так же как у мутантов abr и abr35S::AP1, отмечена высокая частота проростков с тремя семядолями (табл. 1). Растения abr ap1-1 из F2 от скрещивания мутантов характеризовались увеличением продолжительности юве-нильной стадии не только по сравнению с диким типом, но и мутантом ap1-1, зацветающим несколько позже, чем дикий тип. Отличий по этому показателю от растений abr не выявлено. Это видно по числу розеточных листьев, которых у двой-
Таблица 1. Морфологические параметры растений исследуемых линий A. thaliana
Генотип Доля (%) 3-семя-дольных проростков Количество ро-зеточных листьев Высота растений* (см) Количество вегетативных узлов цветоноса* Количество генеративных узлов цветоноса*
Дикий тип 0 7.5 ± 0.5 32.2 ± 0.9 3.5 ± 0.1 33.8 ± 1.5
йЫ 58.3 12.3 ± 0.9 18.1 ± 0.8 3.0 ± 0.3 11.8 ± 1.9
ар1-1 0 9.5 ± 0.5 22.1 ± 1.4 5.2 ± 0.4 26.2 ± 2.5
^г йp1-1 50 11.0 ± 1.6 11.5 ± 3.7 3.4 ± 0.9 7.4 ± 1.1
358::АР1 0 1.. ± 0.2 3.6 ± 1.8 2.7 ± 0.9 2.4 ± 0.8
^г 358::АР1 56.6 7.3 ± 0.7 6.8 ± 1.1 3.1 ± 0.7 3.0 ± 0.2
*Учитывали показатели главного побега (цветоноса).
ного мутанта Мг ap1-1 было примерно столько же, сколько у abr (табл. 1).
Первый цветок на цветоносе двойного мутанта abr ap1-1, как и мутанта abr и растений дикого типа, формировался после развития 3—4 вегетативных узлов. Растения мутанта ap1-1 формировали цветок на 5-6-м узле цветоноса (табл. 1). Число генеративных узлов на главном цветоносе у двойного мутанта снижено по сравнению с растениями дик
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.