МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 368-376
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.852.013:577.113
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ХРОМОСОМНОЙ И ПЛАЗМИДНОЙ ДНК
У ШТАММОВ АСЮИШОВЛаЬЬШ ГЕЯЯООХЮЛт, АДАПТИРОВАННЫХ К РАЗНЫМ СУБСТРАТАМ ОКИСЛЕНИЯ
© 2004 г. Т. Ф. Кондратьева*, В. Н. Данилевич**, С. Н. Агеева*, Г. И. Каравайко*
*Институт микробиологии РАН, Москва **Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Поступила в редакцию 20.06.02 г.
Проведен рестрикционный анализ двух плазмид, рТБК1 и рТРК2, выделенных из штамма АайиЫо-ЬаеШш ferrooxidans ТББк, и определены их размеры (13.5 и 30 тпн соответственно). Для плазмиды рТБК1 построена макрорестрикционная карта. Обе плазмиды имеют гомологичные нуклеотидные последовательности, что видно из данных ДНК-ДНК гибридизации. Плазмида рТБК2 меченая 32Р была использована в качестве зонда для гибридизации по Саузерну с блотами ХЬа1-фрагментов хромосомной ДНК штаммов А. ferrooxidans, выращенных на среде с закисным железом или адаптированных к разным субстратам окисления. На многих фрагментах хромосомной ДНК изученных штаммов были отмечены слабые сигналы гибридизации. При адаптации к новым субстратам окисления локализация полос со слабым сигналом гибридизации в ряде случаев изменялась. Некоторые фрагменты хромосомной ДНК штаммов, адаптированных к новым субстратам окисления, давали сильные сигналы гибридизации с рТБК2. На основании полученных результатов обсуждается возможная роль КТ-элементов и плазмид в адаптации А. ferrooxidans к новым энергетическим субстратам, в микроэволюционных процессах и в штаммовом полиморфизме.
Ключевые слова: штаммы AcidithioЬacillus ferrooxidans, плазмиды, хромосомная ДНК, рестрикционный анализ, гибридизация по Саузерну.
Ацидофильная, хемолитоавтотрофная бактерия AcidithioЬacillus ferrooxidans, получающая энергию за счет окисления Бе2+, 80/82- или сульфидных минералов, характеризуется штаммовым полиморфизмом структуры хромосомной ДНК. Из разных географических зон, различных типов субстратов, из пульп концентратов, полученных при обогащении сульфидных руд, выделено большое число штаммов А. ferrooxidans, различающихся макрорестрикционными профилями хромосомной ДНК, которые были изучены методом пульс-электрофореза [1, 2]. Одним из основных факторов среды, вызывающих структурные изменения хромосомной ДНК, является субстрат окисления [3-6]. Это было показано при изучении влияния адаптации штаммов A.ferrooxidans к новым энергетическим субстратам [3-5] или к повышенной концентрации Бе3+ на структуру хромосомной ДНК [6], а также в процессе мониторинга структуры хромосомной ДНК штаммов в природных условиях при изменении характеристики руды одного и того же месторождения (степени ее окисленности и содержания сурьмы) [5]. Был высказан ряд предположений о механизмах возникновения изменений в структуре хромосомной ДНК [3, 4]. Изменения числа и размеров фрагментов, образующихся при расщеплении на-
тивной хромосомной ДНК эндонуклеазами рестрикции, могут возникнуть в результате метилирования нуклеотидов в сайтах рестрикции, или внут-рихромосомных либо плазмидно-хромосомных рекомбинаций, или изменения локализации инсер-ционных элементов (КТ-элементов). Возможность изменения локализации КТ-элементов при длительном культивировании в присутствии повышенной концентрации ионов меди в среде была показана в работе [7]. Большая часть изученных нами штаммов А. ferrooxidans содержит плазмиды [8]. У ряда штаммов, адаптированных к высоким концентрациям ионов металлов или к новым субстратам окисления, показаны изменения в процессе адаптации и в структуре хромосомной ДНК, и в плазмидных профилях [8-10], что позволяет предположить возможность интеграции или вырезания плазмидной ДНК из хромосомы. Результатом обмена генетической информацией между плазмидной и хромосомной ДНК является, например, локализация экспрессируе-мых генов устойчивости к ртути на хромосомной ДНК и отдельных генов дефектного ртутного опе-рона на плазмиде рТР-БС2 А. ferrooxidans [11], а также наличие копий нескольких хромосомных генов на плазмиде рТР5 [12].
Целью данной работы явилось изучение структуры двух плазмид штамма A. ferrooxidans ТГВк и гибридизация по Саузерну плазмиды рТБК2 с •лотами макрорестрикционных профилей хромосомной ДНК пяти штаммов A. ferrooxidans, адаптированных к разным субстратам окисления.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы бактерий и условия роста. Работу проводили с 3 штаммами бактерий A. ferrooxidans, выделенными из плотных пульп в реакторах при испытаниях биогидрометаллургических технологий вскрытия золота в концентратах, полученных при обогащении пиритно-арсенопиритных руд Нежда-нинского (штамм ТРК-ё), Бакырчикского (штамм ТРБк), Олимпиадинского (штамм ТГО) месторождений, а также с штаммом ТГУ-1, выделенным из растворов при кучном выщелачивании меди из забалансовой медной руды Волковского месторождения, и штаммом ТБЬ-2, выделенным из пульпы хвостов цикла доводки медно-пиритно-го промпродукта. Набор фрагментов ДНК известных размеров штамма ВКМ В-458 A. ferrooxi-dans использовали в качестве размерного стандарта [1]. Все штаммы были адаптированы к элементной сере, пириту и концентрату руды Не-жданинского месторождения путем 20 и более пассажей на среде с каждым из субстратов до достижения максимальной скорости роста и окисления субстрата, не изменяющейся при дальнейших пассажах на том же субстрате [9]. Состав сред и условия культивирования приведены ранее [9].
Получение препаратов хромосомной ДНК и ее анализ. Препараты хромосомной ДНК штаммов A. ferrooxidans получали методом, описанным в работе Кондратьевой с соавт. [1]. Хромосомную ДНК расщепляли рестриктазой Xbaí, и образующиеся фрагменты разделяли пульс-электрофорезом [1]. Помимо анализа структуры хромосомной ДНК гели использовали в экспериментах по гибридизации с меченой по фосфору ДНК плазмиды рТГК2 штамма A. ferrooxidans ТТБк (см. ниже).
Получение препаратов плазмидной ДНК. Плаз-мидную ДНК из биомассы штамма A. ferrooxidans ТГБк выделяли по щелочной методике [13] с некоторыми модификациями. После нейтрализации щелочного лизата ацетатом калия ДНК осаждали 0.7 объема изопропанола и растворяли в ТЕ-буфере. Раствор ДНК далее обрабатывали фенолом, насыщенным 1М Трис-НС1, рН 8.0. После обработки фенолом смесь центрифугировали 3 мин при 9000 К водной фазе добавляли равный объем хлороформа для удаления следов фенола. Встряхивали 1 мин и центрифугировали 1 мин при 9000 Для осаждения ДНК к водной фазе добавляли 0.8 объема изопропанола, тщательно встряхивали и оставляли на несколько минут. Центрифугировали при 9000 Супернатант
сливали, осадок с ДНК промывали 1 мл 70 % этанола, подсушивали на воздухе и растворяли в 50 мкл дистиллированной воды или ТЕ-буфера.
Рестрикционный анализ плазмидной ДНК. В
работе использовали 14 эндонуклеаз рестрикции: EcoRI, EcoRV, XhoI, PstI, HindIII, PvuII, BamHI (рабочий буфер R + BSA, Fermentas); SalI, BglII (рабочий буфер Promega D); KpnI, DraI, HpaI (рабочий буфер B + BSA, Fermentas); XbaI, HindII (рабочий буфер Y + BSA, Fermentas). Активность рестрик-таз составляла 5-10 ед/мкл. Обработку ДНК рес-триктазами (одиночное расщепление) проводили в буферных растворах, указанных выше. Предварительно активность всех рестриктаз была проверена на ДНК фага лямбда.
Одиночные расщепления образцов плазмидной ДНК рестриктазами проводили в следующих условиях. Реакционная смесь содержала 3 мкл раствора плазмидной ДНК + 1 мкл соответствующего 10 х буфера + 6 мкл H2O + 1 мкл рестрикта-зы. Инкубацию проводили в течение 2 ч при 37°С. По окончании реакции в пробирки вносили по 1.5 мкл буфера с красителем бромфеноловым синим для остановки реакции. Смесь переносили в лунки 1 %-ного агарозного геля и проводили электрофорез.
Двойные расщепления образцов ДНК плазмиды pTFK1 проводили следующими рестриктазами: SalI + EcoRI, SalI + PstI, SalI + BglII, SalI + DraI, SalI + PvuII, EcoRI + DraI, PstI + DraI, BglII + DraI (рабочий буфер Promega D); KpnI + DraI, DraI + + PvuII (рабочий буфер B + BSA); XbaI + HindIII (рабочий буфер Y + BSA); XhoI + EcoRI, EcoRI + + PstI, EcoRI + BglII, EcoRI + PvuII, PstI + BglII, PstI + PvuII, BglII + PvuII (рабочий буфер R + BSA). Условия двойных расщеплений плазмидных ДНК рестриктазами были следующими: 3 мкл раствора ДНК + 6 мкл H2O + 1.1 мкл соответствующего 10х буфера + 0.5 мкл фермента 1 + 0.5 мкл фермента 2. Инкубацию ДНК с рестриктазами проводили в течение 4 ч при 37°C. Реакцию останавливали добавлением 1.5 мкл буфера с красителем. Смесь переносили в лунки 1%-ного агарозного геля. Образцы ДНК подвергали электрофорезу. Фотографирование агарозных гелей после электрофореза проводили в системе для гель документирования Bio-Profol с цифровой видеокамерой фирмы Vilber Lourmat (США).
Перенос и гибридизация по Саузерну. В опытах по гибридизации были использованы агарозные гели с XbaI-фрагментами (макрорестриктами) хромосомных ДНК различных штаммов A. ferrooxidans, разделенными методом пульс-электрофореза. Поскольку размер фрагментов ДНК, разделенных этим методом, достигает сотен т.п.н., гели перед переносом предварительно вымачивали в 0.25 N HCl в течение 15 мин. Далее гели инкубировали в 0.4 N NaOH, как описано в [14]. После отмывки от
ll.5
Рис. 1. Двойные расщепления плазмиды рТБК1 штамма А. ferrooxidans ТББк эндонуклеазами рестрикции (слева направо): 1, 9 - ДНК фага лямбда, расщепленная ЯотйЯП + EcoRI и Pstl соответственно, 2 - Pstl + + BglII, 3 - PstI + DraI, 4 - PstI + РуиП, 5 - BglII + DraI, 6 - Bg/II + РуиП, 7 - DraI + РуыИ, 8 - EcoRI + PstI. Сбоку панелей указаны размеры фрагментов ДНК в т.п.н (здесь и далее).
щелочи осуществляли перенос ДНК (блотинг) на нейлоновые мембраны. Использовали Gene Screen Plus гибридизационные мембраны фирмы Du Pont (США). Перенос ДНК осуществляли активным способом, используя устройство для вакуумного переноса фирмы LKB. Все операции, включая перенос ДНК на мембраны, предгибридизацию и гибридизацию мембран с меченой ДНК (зондом), а также последующие процедуры отмывки мембран осуществляли в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.