ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 461, № 6, с. 724-728
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, ^^^^^^^^^^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.171.22#591.25:595.77
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИНСУЛИНОВОГО И ДОФАМИНОВОГО СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ В КОНТРОЛЕ ПРИСПОСОБЛЕННОСТИ
БгозоркИа melanogaster
© 2015 г. И. Ю. Раушенбах, Е. К. Карпова, А. А. Алексеев, Н. В. Адоньева, Л. В. Шумная, Н. Е. Грунтенко
Представлено академиком РАН В. К. Шумным 10.10.2014 г. Поступило 04.12.2014 г.
БО1: 10.7868/80869565215120257
Давно установлено, что у всех многоклеточных животных в неблагоприятных условиях развивается нейроэндокринная стресс-реакция, способствующая адаптации [1]. Одним из гормонов, участвующих в развитии этой реакции у имаго D. melanogaster, является дофамин, уровень которого резко возрастает при стрессе [1]. Известно также, что важную роль в контроле устойчивости к различным типам стрессирующих воздействий играет высоко консервативный сигнальный путь инсулина/инсулиноподобных факторов роста [2]. У дрозофилы этот путь включает в себя восемь инсулиноподобных пептидов (DILP1-8), транскрипционный фактор семейства Forkhead box class O (dFOXO), инсулиноподобный рецептор (InR) и ортолог субстрата инсулинового рецептора млекопитающих CHICO [2, 3]. Показано, что абляция медиальных нейросекреторных клеток, продуцирующих инсулиноподобные пептиды, ведет к снижению устойчивости самок D. melanogaster к температурным стрессам, но повышает их устойчивость к голоданию [4]. Сходную закономерность мы обнаружили ранее у имаго D. melanogaster с мутацией ebony, удваивающей уровень дофамина: самки и самцы этой линии характеризовались сниженной по сравнению с диким типом устойчивостью к тепловому стрессу, но повышенной — к голоданию [5]. Исходя из этих данных, мы предположили, что инсулиновый и до-
Институт цитологоии и генетики
Сибирского отделения Российской Академии наук,
Новосибирск
E-mail: nataly@bionet.nsc.ru
Институт химической кинетики и горения
им. В.В. Воеводского
Сибирского отделения Российской Академии наук, Новосибирск
фаминовый сигнальные пути могут взаимодействовать в контроле приспособленности имаго дрозофилы.
Для того, чтобы проверить наше предположение, мы использовали следующую модель. Ранее мы установили, что у самок, но не у самцов дрозофилы ювенильный гормон (ЮГ), играющий роль гонадотропина и являющийся гормоном стресса у имаго насекомых, регулирует уровень дофамина: повышение/снижение уровня ЮГ у молодых самок вызывает снижение/повышение уровня дофамина [6]. Мы также показали, что снижение экспрессии гена InR в corpus allatum (CA — железа, продуцирующая ЮГ) вызывает снижение уровня ЮГ у имаго D. melanogaster [7]. Одними из основных компонентов приспособленности являются способность выжить в неблагоприятных условиях и способность оставить потомство. Таким образом, оценив уровень дофамина, плодовитость и устойчивость к голоданию у самок и самцов с нокдауном гена InR в CA, мы сможем верифицировать наше предположение.
Для получения мух с нокдауном гена InR в СА были использованы две линии D. melanogaster: линия p[UAS-RNAi-InR]/CyO, несущая антисмысловой су-прессор гена InR [8], и линия Aug21>/Cyo::arm-GFP, несущая драйвер Aug21-Gal4 (Aug21>), специфически экспрессирующийся в СА [9]. Скрещивание этих линий даёт 2 типа потомства: Aug21>/p[UAS-RNAi-InR] со сниженной экспрессией гена InR в СА и их сибсы p[UAS-RNAi-InR]/Cyo::arm-GFP с неизмененным уровнем инсулиновых рецепторов [10]. Второй тип потомков использовали в качестве контроля. Учитывая данные литературы об усилении РНК-интерферентного фенотипа при развитии особей при повышенной температуре [11], скрещивания проводили при 29°C; после вылета мух переносили в условия содержания при температуре 25°C. Синхронизацию культур проводили по вылету имаго (собирали мух, вылетев-
(a)
20
16
ce о о
S 12
(-С «
о
5 8 «
ce
X
6
о ч о
С
ninR+
П InR-
35
30
25
20
15
10
(б)
□ Контроль dL-ДОФА
Самки
Самцы
Самки
Самцы
Рис. 1. Влияние нокдауна гена InR в corpus allatum (а) и обработки L-ДОФА мух линии Canton S дикого типа (б) на уровень дофамина у 2-дневных самцов и самок D. melanogaster. Здесь и на рис. 2 и 3 InR--мухи с нокдауном гена InR
(Aug21>/p[UAS-RNAi-InR]), InR+ - контрольные особи (p[UAS-RNAi-InR]/Cyo::arm-GFP); L-ДоФА - мухи, обработанные L-дигидроксифенилаланином; M± m, n = 12, ромбы — p < 0.001 по сравнению с контролем.
5
0
0
ших в течение 3—4 ч). Мух подвергали голодово-му стрессу по следующей схеме: после вылупле-ния самок отделяли от самцов и по 5 особей помещали в стаканы, дно и 1 см стенок которых покрывали фильтровальной бумагой, смоченной 0.5 мл питательной среды, содержащей 0.03% сахарозы, растворенной в воде. Ежедневно мух переносили на свежую питательную среду и подсчитывали число живых особей в каждом стакане. В течение всего эксперимента мух содержали при 25°С. Выживаемость определяли как процент живых мух в каждом стакане. Содержание дофамина измеряли методом ВЭЖХ [12]. Достоверность результатов оценивали с помощью критерия t Стьюдента.
Результаты измерения уровня дофамина у молодых (2-дневных) самок и самцов Aug21>/p[UAS-RNAi-InR] (далее 1пЯ—) с нокдауном гена InR в СА и контрольных особей p[UAS-RNAi-InR]/Cyo::arm-GFP (далее 1пЯ+) показаны на рис. 1а. Как и ожидалось на основании наших предыдущих данных о том, что ЮГ регулирует уровень дофамина у самок, но не у самцов дрозофилы [6], содержание амина оказалось резко повышенным у самок 1пЯ— со сниженным уровнем ЮГ [7] по сравнению с контрольными особями 1пЯ+, тогда как самцы обеих исследуемых групп
не различались по этому параметру. Таким образом, мы располагаем моделью, позволяющей оценить взаимодействие дофаминового и инсулино-вого сигнальных путей в контроле приспособленности дрозофилы (плодовитость и устойчивость к голодовому стрессу).
Ранее мы показали, что повышение уровня ЮГ вызывает увеличение плодовитости [13], а повышение уровня дофамина — ее снижение [14]. Для того, чтобы установить, опосредуется ли влияние инсулинового сигнального пути на репродуктивную функцию дрозофилы дофамином, мы сравнили уровень плодовитости самок InR— и InR+, оплодотворенных самцами своего генотипа, с плодовитостью самок линии дикого типа Canton S (CS), оплодотворенных самцами InR— или InR+. Результаты представлены на рис. 2а. Ясно, что плодовитость самок InR— с резко повышенным уровнем дофамина (рис. 1а) резко снижена по сравнению с самками InR+. Вместе с тем самцы InR— и InR+, характеризующиеся одинаковым уровнем дофамина (рис. 1а), не различаются по репродуктивной способности. Плодовитость самок CS, оплодотворенных самцами InR—, не отличается от их плодовитости при скрещивании с самцами InR+.
726 РАУШЕНБАХ и др.
Плодовитость, число яиц/самка
Выживаемость, %
Рис. 2. Влияние снижения экспрессии гена InR в corpus allatum на репродуктивную функцию (а) и устойчивость к голоданию (б) самок и самцов D. melanogaster. M± m, n = 10, ромб — при сравнении показателей самок InR— и InR+.
На рис. 2б представлены результаты оценки выживаемости самок и самцов с нокдауном гена InR в CA (InR—) и контрольных мух (InR+) в условиях голодания. Хорошо видно, что с 4-го
дня после вылета начинается гибель самок и самцов обеих исследуемых групп. Однако начиная с 10-го дня эксперимента самки 1пЯ— оказываются более устойчивыми к голоданию, чем контроль-
Выживаемость, %
Рис. 3. Влияние голодания на выживаемость самок и самцов линии Canton S D. melanogaster, получавших в составе корма L-ДОФА, и контрольных мух. M ± m, n = 10, ромб — достоверность различий между обработанными L-ДОФА и контрольными самками приp < 0.05, два ромба — приp < 0.01, три ромба — приp < 0.001; * — p < 0.05, ** — p < 0.01, *** — p < 0.001 по сравнению с контролем.
ные особи. Вместе с тем самцы исследуемых групп по устойчивости к голоданию не различаются. Таким образом, мы можем сделать вывод, что влияние инсулинового сигнального пути на устойчивость имаго D. melanogaster к голодовому стрессу опосредуется дофамином.
Для того, чтобы подтвердить это заключение, мы исследовали влияние экспериментального повышения уровня дофамина на устойчивость самцов к голоданию. Повышение уровня дофамина у особей дикого типа линии CS осуществляли, добавляя в питательную среду 0.07% предшественника дофамина, Ь-дигидроксифенилалани-на (Ь-ДОФА) [12]. Результаты измерения уровня дофамина у молодых (2-дневных) самок и самцов линии CS, в питательную среду которых добавляли Ь-ДОФА, и контрольных мух приведены на рис. 1б. Видно, что кормление мух предшественником дофамина вдвое повышает уровень последнего и у самок, и у самцов дрозофилы.
Результаты оценки выживаемости при голодании самок и самцов линии CS с повышенным уровнем дофамина и контрольных мух (рис. 3) подтвердили наше заключение о том, что именно повышение уровня дофамина у самок D. melano-gaster с нокдауном гена InR в СА обеспечивает их повышенную устойчивость к голодовому стрессу. Действительно, самцы с повышенным уровнем дофамина так же, как и самки, характеризуются повышенной жизнеспособностью при го-
лодании: выживаемость мух с повышенным уровнем дофамина начиная с 14 дня эксперимента, достоверно превышает таковую у контрольных особей.
Авторы выражают глубокую благодарность профессору Жану-Рене Мартину (Лаборатория клеточной и молекулярной биологии, Гиф-сюр-Иветт, Франция) за предоставление линии p[UAS-RNAi-InR]/CyO и профессору Шенгу Ли (Шанхайский Институт Биологических Наук, АН КНР) за предоставление линии Aug21-Gal4/Cyo::arm-GFP.
Настоящая работа поддержана грантом РФФИ № 13-04-00019, 15-04-02934 и БП № VI. 53.2.3.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Грунтенко Н.Е. Стресс и размножение насекомых: гормональный контроль. Новосибирск; М.: Т-во науч. изданий КМК, 2008. 43 с.
2. Toivonen J.M., Partridge L. // Mol. and Cell. Endocrinol. 2009. V. 299. P. 39-50.
3. Kannan K, Fridell Y.W. // Front. Physiol. 2013. V. 4. P. 288. DOI: 10.3389/fphys.2013.00288.
4. Broughton S.J., PiperM.D., Ikeya T, et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. 2005. V. 102. P. 3105-3110.
5. Gruntenko N.E., Chentsova N.A., Bogomolova E.V., etal. // Arch. Insect Biochem. a
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.