БИОХИМИЯ, 2013, том 78, вып. 2, с. 230 - 242
УДК 577.121
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОРОТКИХ ПЕПТИДОВ С FITC-МЕЧЕНЫМИ ГИСТОНАМИ ПШЕНИЦЫ И ИХ КОМПЛЕКСАМИ С ДЕЗОКСИРИБООЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ
© 2013 г. Л.И. Федореева12, Т.А. Смирнова12, Г.Я. Коломийцева2, В.Х. Хавинсон3, Б.Ф. Ванюшин1,2*
1 ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, 127550 Москва, ул. Тимирязевская, 42
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва; электронная почта: vanyush@belozersky.msu.ru
3 Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии,
197110 Санкт-Петербург, просп. Динамо, 3
Поступила в редакцию 22.07.12 После доработки 08.10.12
С помощью тушения флуоресценции показано, что короткие пептиды (Л1а-01и-Ар-01у, 01и-ЛБр-Л^, Л1а-01и-ЛБр-Ьеи, Ьу8-01и-ЛБр-01у, А1а-01и-Лр-Ащ и 1^-01и-ЛБр-Тгр) связываются с ПТС-мечеными гисто-нами пшеницы Н1, Н2в, Н3 и Н4. В случае гистона Н1 тушение флуоресценции происходит за счет взаимодействия пептидов с ^-концевыми областями гистонов, которые содержат соответствующие гомологичные пептид-связывающие мотивы. Так как в кор-гистонах пшеницы гомологичные аминокислотные последовательности нами не найдены, пептиды, по-видимому, связываются с некими особыми конформационны-ми участками этих гистонов. Связывание пептидов с гистонами и комплексами гистон-дезоксирибоолиго-нуклеотид зависит от природы гистона, первичной структуры пептида и олигонуклеотида, т.е. существует сайт-специфическое взаимодействие коротких пептидов с гистонами и комплексами гистон-олигонуклео-тид. Гистон Н1 предпочтительно связывается с однотяжевыми олигонуклеотидами через гомологичные участки в С-концевой области белка. В отличие от гистона Н1, коровые гистоны преимущественно связываются с двутяжевыми метилированными олигонуклеотидами и метилированной ДНК. Константы Штер-на-Фольмера взаимодействия гистонов Н1 и кор-гистонов с двутяжевыми полуметилированными олигонуклеотидами выше, чем с неметилированными. ДНК или дезоксирибоолигонуклеотиды в составе комплекса с гистонами могут усиливать или препятствовать связыванию пептидов. Предполагается, что сайт-специфические взаимодействия коротких пептидов с гистонами в хроматине могут служить контрольным эпигенетическим механизмом регуляции активности генов и клеточной дифференцировки.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: гистоны, короткие пептиды, взаимодействие, связывание, комплексы гистон-оли-гонуклеотид-пептид, метилирование ДНК, пшеница, растения, эпигенетика.
Короткие пептиды в качестве сигнальных молекул могут запускать или напротив ингиби-ровать самые различные генетические процессы и биохимические реакции в клетке [1]. Молекулярные механизмы действия коротких пептидов во многом неизвестны. Одним из таких механизмов может быть сайт-специфичес-
Принятые сокращения: FITC — флуоресцеин-изо-тиоцианат.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 12-232, 13.01.2013.
** Адресат для корреспонденции.
кое взаимодействие пептидов с ДНК, приводящее к изменению характера транскрипции ДНК и экспрессии генов [1]. Короткие пептиды могут не только сайт-специфично связываться с ДНК, но и «распознавать» их по статусу метилирования, т.е. они по-разному взаимодействуют с метилированными и неметилированными последовательностями ДНК [2]. Такое специфическое связывание пептидов с ДНК, по-видимому, может конкурировать со связыванием ДНК с разными оперирующими с ней белками, в том числе ферментами (эндо-нуклеазами, РНК- и ДНК-полимеразами, ДНК-метилтрансферазами и др.). Установле-
но, что отдельные короткие пептиды действительно модулируют действие эукариотических эндонуклеаз [3]. В свою очередь, это влияние пептидов на действие эндонуклеаз модулируется гистонами (гистон Н1) [3]. Не исключено, что такая измененная гистонами модуляция действия эндонуклеаз пептидами, в известной мере, может быть обусловлена белок-белковыми взаимодействиями пептидов с гистонами. В настоящее время о взаимодействии коротких пептидов с гистонами практически ничего неизвестно. Между тем, такие взаимодействия могут оказаться весьма существенными при действии коротких пептидов в клетке на уровне хроматина.
Цель работы — изучение взаимодействия разных коротких пептидов с пшеничными FITC-мечеными гистонами (подфракции гисто-на Н1, коровые гистоны) и их комплексами с де-зоксирибоолигонуклеотидами разной первичной структуры.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Гистоны выделяли из четырех—пятидневных проростков озимой пшеницы сорта Мироновская 808 (Triticum aestivum L.). Выращивание и частичную синхронизацию роста проростков проводили как описано ранее [4]. Из проростков пшеницы сначала получали препарат частично очищенных клеточных ядер [5], из которого экстрагировали суммарные гистоны с помощью 0,25 М H2SO4 или только гистон Н1 экстракцией 0,74 М HClO4 [5, 6]. Экстракции проводили трижды с использованием ультразвуковой обработки, гистоны осаждали из объединенного экстракта подкисленным ацетоном. Промытые ацетоном и подсушенные осадки белков растворяли в буфере для электрофореза и разделяли в 15%-ном ДС-Na-nAAT. После окрашивания геля кумасси R-250 соответствующие отдельным белкам полосы вырезали, и белки выделяли из геля с помощью электроэлюции как описано ранее [6]. Элюированные белки осаждали и обрабатывали, как при выделении суммарного Н1, и перерастворяли в деионизо-ванной воде. Концентрацию белка в полученных препаратах определяли по окрашиванию аликвот на мембране по методу [7] по построенной калибровочной кривой.
Меченые флуоресцеин изотиоцианатом (FITC) гистоны были получены добавлением раствора FITC в 0,5 М бикарбонате натрия к раствору индивидуальных подфракций гистона Н1 [8]. Введение флуоресцентной метки в белки осуществляли при соотношении белок — флуорозонд
1 М : 1 М. Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при перемешивании. Свободный FITC удаляли пропусканием раствора через мембрану Amicon 3000. Полученные FITC-меченые гистоны анализировали путем хроматографии в хроматографе «Bio-Logic DuoFlow» (США) на колонке С-4 в градиенте концентрации ацетонитрила (0—100%), содержавшего 1%-ную трифторуксусную кислоту.
Эффективность включения флуоресцентной метки в гистоны определяли по спектру поглощения, используя уравнение:
[FITC - H] = (A280 - 0,24 A49s)/é l ,
где А — поглощение при данной длине волны, s- коэффициент экстинкции гистонов, равный 4470 М-1 см-1 (при предположении, что спектр поглощения собственно белка существенно не изменяется при модификации), l - длина оптического пути, см [9]. Флуоресцентная метка включилась в белки примерно в молярном соотношении 1 : 1 (0,8-1,2), и флуоресцентный зонд локализован на ^-концевой а-аминогруппе белков [8].
Спектры флуоресценции получали при возбуждении светом с длиной волны 413 нм и реги-стрировалии на спектрофлуориметре «Perkin-Elmer LS 55» (США) в диапазоне от 480 до 580 нм. Спектры поглощения снимали на спектрофотометре «Cary 300» (США).
Дезоксирибоолигонуклеотиды с заданной первичной структурой были синтезированы и любезно предоставлены нам ЗАО «Синтол» (Москва). Комплементарные олигонуклеотиды сплавляли между собой и в результате были получены как неметилированные, так и полуметилированные двутяжевые олигонуклеотиды.
ДНК фага X приобретены у фирмы «Fermentas» (Литва). В отличие от неметилированной ДНК (dcm-, dam) метилированная ДНК (dcm+, dam+) этого фага содержит остатки 5-метилци-тозина в последовательностях Cm5CWGG и остатки ^-метиладенина в Gm6ATC-сайтах.
В работе использовали пептиды - эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly), пинеалон (Glu-Asp-Arg), брон-хоген (Ala-Glu-Asp-Leu), тестаген (Lys-Glu-Asp-Gly), кардиоген (Ala-Glu-Asp-Arg) и панкраген (Lys-Glu-Asp-Trp), синтезированные в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии. Чистоту синтетических пептидов проверяли и при необходимости дополнительно очищали с помощью хроматографии на хроматографе «BioLogic DuoFlow» на колонке С-18 в градиенте концентрации ацетонитрила (0-60%), содержавшего 1%-ную трифторуксусную кислоту.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 показано электрофоретическое разделение гистона Н1, выделенного из фракции частично очищенных клеточных ядер проростков пшеницы. В отличие от гистона Н1, выделенного из печени крысы (рис. 1), гистон Н1 пшеницы в SDS-ПААГ разделяется на шесть компонентов (полос) с более низкой электро-форетической подвижностью, которая характерна индивидуальным белкам [5]. Для работы были выбраны подфракции гистона Н1, соответствующие полосам с наибольшей (Н1/1), средней (Н1/3) и наименьшей (Н1/6) электрофоре-тической подвижностью. Эти белки были выделены из геля методом электроэлюции и идентифицированы с помощью масс-спектрометрии в соответствии с приводимыми в базе ^СВ1) данными по первичной структуре подфракций гистона Н1 пшеницы.
Коровые гистоны пшеницы при DS-Na-ПААГ-электрофорезе также обладали иной подвижностью по сравнению с кор-гистонами животных (рис. 1, в, г). Пшеничные, как и животные, гистоны Н3 и Н4 представлены одной полосой, а растительные гистоны Н2а и Н2в располагаются не между Н3 и Н4, а выше Н3 и каждый из них представлен двумя полосами (компонентами).
Для изучения пептид-белковых взаимодействий был использован метод тушения флуоресценции. Из всех заметно флуоресцирующих аминокислотных остатков растительные гисто-ны содержат только остатки тирозина. Введение флуоресцентного зонда (флуоресцеин изотио-цианата, ИТС) в гистоны позволило увеличить чувствительность метода по сравнению с измерением собственной флуоресценции белков. Максимум спектров флуоресценции всех флуоресцентно-меченых гистонов соответствовал ~515 нм (рис. 2). Это свидетельствовало о том, что микроокружение флуоресцентного зонда во всех гистонах достаточно одинаково. Такое сходство спектров флуоресценции гистонов позволило провести сравнительное изучение влияния пептидов и дезоксирибоолигонуклео-тидов на микроокружение флуорофора в гисто-нах. Во всех экспериментах мы использовали одну и ту же концентрацию ИТС-гистонов.
Использованные пепти
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.