МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 4, с. 682-686
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 576.08;578.233.42
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕЖДУ Daxx И БЕЛКОМ E2 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА (ТИП 16)
© 2014 г. S. Y. Tang1f, L. LP, Y. Liu1, A. Y. Liu1, M. J. Yu1, Y. Zhang1, L. Z. Liu1, Y. P. Wan1*
1Pathogenic Biology Institute, University of South China, Hengyang 421001, P. R. China 2School of Public Health, University of South China, Hengyang 421001, P. R. China Поступила в редакцию 18.01.2014 г. Принята в печать 12.02.2014 г.
Целью работы стало изучение взаимодействия белка E2 вируса папилломы человека (HPV16) и белка, ассоциированного с доменом смерти (Daxx). Локализацию и колокализацию белка промиелоцитарного лейкоза (PML) и E2 с Daxx в клетках Caski наблюдали с помощью метода непрямой иммунофлуорес-ценции. Взаимодействие E2 с Daxx анализировали методами коиммунопреципитации и вестерн-блотин-га, а также в дрожжевой двугибридной системе. Флуоресцентные сигналы от Daxx и PML главным образом оказались соответственно в цитоплазме и в ядре клеток Caski. На совмещенном снимке по-прежнему были видны оба типа сигнала. В то же время при совмещении красного сигнала от E2 и зеленого сигнала от Daxx они отображаются как желтый в цитоплазме клеток Caski. Дрожжи, трансформированные одновременно плазмидами pGBKT7/Daxx и pGADT7/E2 либо pGADT7/E2 TAD, могут расти на средах SD/-Trp-Leu-His и SD/-Trp-Leu-His-Ade. Таким образом, в клетках Caski белок Daxx не локализуется совместно с PML, но колокализуется с E2 HPV16 — в основном в цитоплазме. Также показано, что E2 HPV16 и его домен активации транскрипции (TAD) могут взаимодействовать с Daxx.
Ключевые слова: вирус папилломы человека типа 16 (HPV16), E2, Daxx, взаимодействие.
INTERACTION OF DAXX AND HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16 E2 PROTEIN, by S. Y. Tanglf, L. Li2t, Y. Liu1, A. Y. Liu1, M. J. Yu1, Y. Zhang1, L. Z. Liu1, Y. P. Wan1* ^Pathogenic Biology Institute, University of South China, Hengyang 421001, China; *e-mail: wanyy1991@aliyun.com; 2School of Public Health, University of South China, Hengyang 421001, China). The aim of the study was to explore the interactions of human papilloma virus 16 (HPV16) E2 protein and Daxx. The location or co-localization of PML and E2 with Daxx in Caski cells was observed by indirect immunofluorescence test. The interaction of E2 and Daxx was analyzed by co-immunoprecipitation, Western-blot and yeast-two hybrid assay. In Caski cells the fluorescence of Daxx or PML was mainly distributed in the cytoplasm or nucleus, respectively, and in the align image their signals did not overlapped. However, when the red signal of HPV16 E2 and the green signal of Daxx in cytoplasm of Caski cells were merged, the yellow signals appeared. The yeast co-transformed with pGBKT7/Daxx and pGADT7/E2 or pGADT7/E2 TAD can grow onto SD/-Trp-Leu-His and SD/-Trp-Leu-His-Ade plates. So Daxx wasn't co-located with PML but with HPV16 E2 mainly in the cytoplasm of Caski cells. On the base of the results one can propose that HPV16 E2, in particularly its transcription-activity domain (TAD), interacts with Daxx.
Keywords: human papillomavirus type16 (HPV16), E2, Daxx, interaction. DOI: 10.7868/S0026898414040168
ВВЕДЕНИЕ
Вирус папилломы человека (HPV) относится к безоболочечным вирусам с икосаэдрическим капсидом и двухцепочечной ДНК. HPV поражает клетки плоского эпителия и вызывает различные заболевания [1], включая рак шейки матки [2]. Несмотря на недавно появившиеся сообщения о
том, что базальная активность белка Е2, а также репрессирование регуляторной области URR или транскрипционная активация белком E2 не коррелируют с канцерогенностью HPV in vivo [3], известно, что кодируемые вирусами папилломы белки E2 играют существенную роль в регуляции экспрессии вирусных генов [4], контроле вирусной репликации и транскрипции [5].
^ Tang S.Y. и Li L. внесли равный вклад в выполнение этой работы.
* Эл. почта: wanyy1991@aliyun.com
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕЖДУ Daxx И БЕЛКОМ E2
683
Белок, ассоциированный с доменом смерти (death domain associated protein, Daxx), — это высококонсервативный ядерный белок, который играет важнейшую роль в контроле транскрипции, канцерогенезе, устойчивости к вирусным инфекциям и т.д. [6]. Этот белок локализуется вместе с онкогенными доменами белка промие-лоцитарного лейкоза (promyleocytic leukaemia protein, PML) в нуклеоплазме, ядрышках, цитоплазме, гетерохроматине. Хотя наиболее часто Daxx детектируют в ядерных тельцах PML (PML-NB), его внутриклеточная локализация может меняться под действием модификаций или взаимодействия с другими белками. В условиях клеточного стресса Daxx способен взаимодействовать со многими молекулами, таким образом оказывая влияние на сигнальные пути клетки [7].
Руководствуясь вышеизложенным, мы исследовали локализацию белков E2 HPV16 и Daxx и их взаимодействие в клетках Caski с целью заложить основу для дальнейшего понимания молекулярных механизмов взаимодействия между Daxx и E2 и их роли в развитии HPV16-индуцируемого рака шейки матки.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Плазмиды и реагенты. Плазмиды pcDNA3.1(+)/Daxx, pcDNA3.1(+)/HPV16 E2, pGADT7/Daxx, клетки Escherichia coli линии BL21 и клетки Caski с полногеномным HPV16 предоставлены Институтом патогенетической биологии университета Южного Китая (Institute of Pathogenic Biology, University of South China). Лигаза T4 и эндонуклеазы рестрикции приобретены у фирмы "Fermentas" (США); набор для по-лимеразной цепной реакции AxyPrep приобретен у "Axygen Biosciences" (США), сорбенты для выделения ST- и His-меченых белков приобретены у "Novagen" (США). Кроличьи антитела против Daxx человека, мышиные антитела к PML человека и к E2 HPV16 человека приобретены у компании "Santa Cruz" (США). Конъюгированные с пе-роксидазой хрена козьи антикроличьи IgG (HRPGAR), антимышиные IgG (HRP-GAM), а также конъюгированные с FITC козьи антикроличьи IgG (FITC-GAR) и TRITC-меченые козьи антимышиные IgG (TRIT-GAM) приобретены у "Sigma" (США). Плазмида pcDNA3.1/HPV16 E2 использована в качестве матрицы для амплификации кодирующих последовательностей E2 HPV16, E2TAD, E2 H-DBD и E2DBD методом ПЦР. Рекомбинант-ные плазмиды pGADT7/E2, pGADT7/E2TAD, pGADT7/E2H-DBD и pGADT7/E2DBD клонированы в вектор E. coli BL21 для проведения рестрик-ционного анализа и секвенирования (данные не приведены).
Иммунофлуоресценция. Клетки Caski культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% фе-
тальной сыворотки крупного рогатого скота (40 г/л) при 37°C. При достижении плотности клеток 50% среду удаляли, а клетки промывали дважды PBS, что повторяли в дальнейшем после каждой обработки. Клетки фиксировали 4%-ным триоксаном в течение 10 мин и затем 0.2%-ным Triton X-100 в течение 10 мин и реакцию останавливали инкубацией с 2% бычьего сывороточного альбумина в течение 1 ч. В течение ночи клетки инкубировали с антителами к Daxx и антителами либо к PML, либо к E2 HPV16, а затем со смесью FITC-GAR, TRITC-GAM и DAPI при 37°C 1 ч. После последней промывки супернатант удаляли и клетки исследовали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа.
Коиммунопреципитация. Анти-GST- либо ан-ти-His-антитела в 500 мкл лизирующего буфера добавляли к смеси очищенных белков или соответственно к GST-E2 HPV16 или His6-Daxx. Смесь медленно перемешивали при 4°C в течение 1 ч, добавляли 20 мкл агарозы с иммобилизованными белками A/G и перемешивали еще 2 ч. Осадок промывали лизирующим буфером (4 раза по 1 мл), центрифугировали, к осадку добавляли буфер для нанесения на гель (с SDS) и нагревали до кипения. После центрифугирования отбирали супернатант и анализировали его с помощью имунно-блотинга. Образцы разбивали на две группы: одну окрашивали антителами к Daxx в качестве первичных антител и HRP-GAR в качестве вторичных, а другую — антителами к E2 и HRP-GAM.
Клетки Caski культивировали 48 ч и дважды промывали холодным PBS. Клетки лизировали при медленном вращении в течение 30 мин при 4°C и центрифугировали. Полученный супернатант обрабатывали так, как описано выше.
Анализ в дрожжевой двугибридной системе.
Дрожжи AH109 трансформировали плазмидами pGBKT7/Daxx, pGADT7, pGADT7/HPV16 E2, pGADT7/HPV16 E2TAD, pGADT7/HPV16 E2H-DBD или pGADT7/HPV16 E2DBD литий-ацетатным методом. Планшеты SD/-Trp, SD/-Leu, SD/-His или SD/-Ade с трансформатами инкубировали от двух до четырех суток при 30°C и анализировали автоактивацию каждого рекомбинанта. Плазмиды разбивали на 7 групп: A (pGADT7 + + pGBKT7), B (pGADT7/T + pGBKT7-Lam), C (pGADT7/T + pGBKT7-p53), D (pGBKT7/Daxx + + pGADT7/HPV16 E2), E (pGBKT7/Daxx + + pGADT7/HPV16 E2TAD), F (pGBKT7/Daxx + + p GADT7/HPV16 E2 H-DBD) и G (pGBKT7/Daxx + + pGADT7/HPV16 E2DBD). Далее проводили котрансформацию дрожжей AH109 плазмидами каждой группы, котрансформанты выращивали на плашках SD/-Trp-Leu-His и SD/-Trp-Leu-His-Ade и инкубировали в течение 2—4 сут при 30°C. Область белка E2 HPV16, которая взаимодейству-
ет с Daxx, идентифицировали по результатам роста клеток дрожжей.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Локализация PML, E2 HPV16 и Daxx в клетках Caski
На снимках синяя флуоресценция относится к ядрам. Флуоресценция Daxx (зеленая) главным образом распределена по цитоплазме клеток Caski, хотя небольшая часть есть и в ядрах. Флуоресценция PML (красная) обнаружена в основном в ядрах клеток Caski. На совмещенном снимке желтое окрашивание не появляется, по-прежнему видны красный и зеленый сигналы (рис. 1). Сигналы флуоресценции, соответствующие Daxx (зеленый) и E2 HPV16 (красный), распределены главным образом по цитоплазме клеток Caski; небольшая часть находится в ядре. При совмещении двух снимков сигналы флуоресценции этих двух белков перекрываются и дают желтый цвет (рис. 2).
GST-E2 — — +
His-Daxx + + +
анти-GST — + +
ИБ с анти-Daxx + + +
1 2 3
GST-E2 + + +
His-Daxx — — +
анти-His — + +
ИБ с анти-Б2 + + +
4 5 6
Рис. 3. Анализ ассоциации Daxx и E2 HPV16 in vitro. Комплекс очищенного белка His6-Daxx с анти-Daxx-антителами как положительный контроль на Daxx (1); комплекс His6-Daxx с анти-Daxx-антителами не захватывается анти^8Т-антителами — отрицате
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.