ШЯЯШ БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2004, том 30, № 2, с. 195-200
ш
УДК 577.127.3: 577.112.824
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НОВЫХ ПИРИДИЛПОРФИРИНОВ С БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ © 2004 г. Н. Г. Карапетян*", В. Н. Мадакян**
''■'Кафедра молекулярной физики физического факультета Ереванского государственного университета,
Армения, 375025, Ереван, ул. Ал. Манукяна, 1; **Кафедра фармацевтической химии Ереванского государственного медицинского университета, Армения
Поступила в редакцию 20.01.2003 г. Принята к печати 28.02.2003 г.
Взаимодействие лезо-тетра(4-А'-гидроксиэтилпиридил)порфирина, .ме.зо-тетра(3-Л/-гидроксиэтил-пиридил)порфирина и их цинковых комплексов с бычьим сывороточным альбумином (БСА) было исследовано методами спектрофотометрии, КД и равновесного диализа при рН 7.2. В электронных спектрах поглощения порфиринов при их титровании БСА наблюдались гипохромное изменение и батохромный сдвиг полосы Соре, а также наличие изосбестической точки. Показано, что при взаимодействии порфиринов с БСА появляются индуцированные, положительные спектры КД в видимой области, что объясняется сорбированием порфиринов на белковой глобуле. Методом равновесного диализа в координатах Скэтчарда определены стехиометрия и константы связывания исследованных порфиринов с БСА. Взаимодействие имеет неспецифический и обратимый характер.
Ключевые слова: круговой дихроизм; пиридилпорфирины; сывороточный альбумин: спектроскопия.
ВВЕДЕНИЕ
Интерес к исследованию порфиринов за последние годы стремительно растет. Широко изучаются как природные, так и синтетические пор-фирины. Весьма перспективны такие области применения порфиринов, как диагностика и лечение злокачественных новообразований, лечение анемии, нейропсихических нарушений, кожных и глазных заболеваний [1, 2]. Было замечено, что некоторые порфирины способны ингибировать репликацию вируса иммунодефицита человека [3]. Особое направление в лечении онкологических заболеваний занимает фототерапия опухолей с использованием порфиринов в качестве сенсибилизаторов [4-6]. Эффективность терапевтического действия этих соединений определяется как физическими свойствами самого порфирина, так и спецификой его связывания с биомолекулами, в том числе и с транспортными белками крови [7, 8].
Транспортные процессы играют значительную фармакологическую роль.. Известно, что многие лекарственные препараты, как и естественные метаболиты в организме человека и животных, связываются с сывороточным альбумином и пе-
Сокращения: БСА - бычий сывороточный альбумин; ЧСА -человеческий сывороточный альбумин; Т40ЕРуР - .незо-те-Tpa(4-/V-rnflpoKCii3TiMniipnAiui)nopc|)npiiH; ТЗОЁРуР - мезо-тетраСЗ-^-гидроксиэтилпиридил)порфирин; ZnT40EPyP и ZnT30EPyP - цинковые комплексы соответствующих порфиринов.
"Автор для переписки (тел.; (374-1) 554341; факс: (374-1) 15108; эл. почта:Yeva@ysu.am).
реносятся к клеткам-мишеням. Для многих порфиринов доказана способность к комплексообра-зованию с белками плазмы - БСА и ЧСА [9, 10].
Следует отметить недостаточную изученность вновь синтезируемых порфиринов с точки зрения их биологической активности. Частично восполняя этот пробел, в настоящей работе мы исследовали новые синтетические водорастворимые порфирины: лгезо-тетра(4-/У-гидроксиэтилпрфидил)порф1г-рин, ,мезс>-тетра(3-/\'-гидроксиэтилпиридил)порфи-рин и их цинковые комплексы [11]. Все они являются катеонитами - положительные заряды расположены на четырех атомах азота пиридиль-ных заместителей. Порфирины в отсутствие иона металла обладают планарной геометрией. В метал-локомплексах порфиринов с цинком (М = Zn2+) атом цинка выходит из плоскости порфиринов, так как имеет координационное число, равное пяти. В этом случае координационный центр МЫ4 становится пирамидальным, и молекула порфирина имеет один аксиальный лиганд [ 12].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее были изучены фармакологические свойства этих соединений, выявлена их противогрибковая, антибактериальная и антивирусная активность. Было показано, что цинксодержащие порфирины увеличивают парциальное давление кислорода артериальной крови, а также обладают общим анальгезирующим действием [13]. Исследовались также и механизмы связывания указанных пор-
фиринов с молекулами ДНК [14]. Однако молеку- альбумином. Эти взаимодействия исследовались
лярные механизмы транспорта этих порфиринов в методами спектрофотометрии и КД в видимой об-
организме не исследовались. Этим объясняется наш ласти при изменении соотношения белок-порфи-
интерес к изучению закономерностей комплексо- Рин в фосфатно-солевом буфере рН 7.2 при 20°С. образования новых синтетических порфиринов с На рис. 1 показано изменение полосы поглоще-
транспортным белком - бычьим сывороточным ния Соре исследуемых порфиринов при их титрова-
X, им
Рис. 1. Электронные спектры поглощения порфиринов и их 2п-комплексов в области полосы Соре при их титровании БСА. Концентрация порфиринов - 5 мкМ, БСА - 0-8 х 1СГ5 М. Символ ами / 0 и ут ооозначены кривые, соответствующие поглощению чистого порфирнна и порфнрина при концентрации БСА 8 х 10~5 М. Шаг увеличения концентрации БСА равен 6 х Ю-6 М. Стрелками указаны изосбестические точки.
1
-1
Рис. 2. Спектры КД комплексов БСА с порфиринами при молярных отношениях БСА-порфирин (/?), равном 1 (/), 2 (2), 3 (i), 4 (4), ц = 0.18; а также равном 4 (5), при 20°С, рН 6.2, ц = 0.18 и равном 4 (б), при 20°С, рН 7.2, ц = 0.5.
нии раствором БСА. При постоянной концентрации порфнринов и постепенном увеличении концентрации БСА в экспериментах (молярное отношение БСА-порфирин (г) менялось в пределах от 0 до 16) в электронных спектрах поглощения порфиринов наблюдается уширение полосы Соре, его сдвиг максимума поглощения в область более длинных волн, а также значительное падение интенсивности поглощения (табл. 1 и рис. 1). Наблюдаемое гипохромное изменение, скорее всего, можно объяснить появлением в растворе комплексов БСА-порфирин, где хромофор находится в более упорядоченной форме по сравнению со своим свободным состоянием [14]. По мере титрования доля связанного порфирина в растворе возрастает, поэтом}' и гипохромное изменение растет
до тех пор, пока весь порфирин не окажется в связанном состоянии, и дальнейшее увеличение концентрации БСА не сказывается на спектрах. Наличие изосбестической точки на спектрах поглощения свидетельствует, что хромофор в растворе может находиться только в двух состояниях - свободном и связанном с БСА. Поэтому мы предполагаем, что каждый из исследованных порфиринов, связываясь с БСА при рН 7.2, образует идентичные комплексы [15, 16].
Взаимодействие порфиринов с БСА исследовали также методом КД в видимой области в диапазоне длин волн 370-450 нм (рис. 2). Использованные в работе порфирины не имеют оптической активности, так как у них отсутствует хиральность. Известно, что белки также в види-
ТЗОЕРуР
г/о х 104, М"'
Рис. 3. Графическая зависимость связывания порфиринов с БСА в координатах Скэтчарда: / -Т40ЕРуР, 2 -ТЗОЕРуР, 3 - гпТ40ЕРуР, 4 - Хл'ГЗОЕРуР. / -молярное отношение связанного порфирина к БСА, су-концентрация свободного порфирина.
мой области не поглощают и не имеют спектров КД [17]. Однако комплексообразование порфиринов с БСА приводит к появлению в видимой области спектров КД с положительным эффектом Коттона в области полосы Соре. Индуцированная оптическая активность является результатом асимметрии комплекса белок-порфирин и проявляется в области поглощения порфиринов. Из рис. 2 видно, что положительный сигнал КД растет с увеличением молярного отношения пор-фирин-альбумин (/?) до 4. Дальнейшее увеличение величины /? не приводит к изменению спектров КД (на рис. 2 не показано). То, что при титровании альбумина порфирином получаются идентичные
Таблица 1. Данные по спектрофотометрическому титрованию порфиринов БСА при рН 7.2
Порфирины Полоса Соре чистого порфирина, X, нм Максимальный батохромный сдвиг, ЛХ, нм Максимальное гипохромное изменение, %
Т40ЕРуР 423 5 36
ТЗОЕРуР 418 3 32
гпТЮЕРуР 437 8 17
гпТЗОЕРуР 428 9 23
положительные спектры КД, также свидетельствует об едином типе связывания.
Константы связывания (Ксв) и стехиометрию комплекса определяли методом равновесного диализа при титровании БСА возрастающими концентрациями порфиринов. По полученным данным построены изотермы связывания в координатах Скэтчарда (рис. 3). Отрезок, отсекаемый на оси абсцисс, дает число участков связывания порфиринов на БСА (п). Поскольку зависимость линейная, то, очевидно, что каждый из исследуемых порфиринов связывается с идентичными и независимыми участками на молекуле БСА.
Исходя из полученных данных (табл. 2), можно заключить, что положение боковых /У-гидро-ксиэтильных групп в порфиринах почти не сказывается на величине их Ксв, В то же время присутствие иона цинка в порфиринах приводит к увеличению Ксв более чем в пять раз, что можно объяснить способностью цинка образовывать дополнительную связь с отрицательно заряженными группами на поверхности белка. А уменьшение числа участков связывания, по-видимому, можно объяснить выходом атома из плоскости кольца, что приводит к определенным стерическим ограничениям. Исследования выявили обратимость комплексообразования порфиринов с БСА для всех случаев. В литературе имеются данные по рентге-ноструктурному анализу и флуоресценции комплексов альбумин-порфир™. На молекулах БСА и ЧСА предполагают наличие одного или двух специфических и нескольких неспецифических мест связывания для различных порфиринов [18, 19]. Некоторые авторы описывают как жесткое связывание с БСА и ЧСА (молекулы порфирина встроены в неполярные центральные домены белковых матриц, константы связывания ~10-М06 М-1), так и слабое связывание (молекулы порфирина сорбированы на поверхности белковых глобул, константы связывания ~103-104 М"1) [15, 20, 21]. При сравнении полученных нами результатов с литературными можно заключить, что мы имеем дело со вторым случаем, т.е. исследованные порфирины сорбируются на поверхности БСА. Образовавшийся комплекс стабилизируется за счет электростатических взаимодействий. Этот вывод следует из того, что сывороточный альбумин имеет н
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.