научная статья по теме ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПИРОФОСФАТА С КАТАЛИТИЧЕСКИМИ И НЕКАТАЛИТИЧЕСКИМИ ЦЕНТРАМИ АТР-СИНТАЗЫ ХЛОРОПЛАСТОВ Химия

Текст научной статьи на тему «ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПИРОФОСФАТА С КАТАЛИТИЧЕСКИМИ И НЕКАТАЛИТИЧЕСКИМИ ЦЕНТРАМИ АТР-СИНТАЗЫ ХЛОРОПЛАСТОВ»

БИОХИМИЯ, 2009, том 74, вып. 7, с. 956 - 962

УДК 577.355.2

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПИРОФОСФАТА С КАТАЛИТИЧЕСКИМИ И НЕКАТАЛИТИЧЕСКИМИ ЦЕНТРАМИ АТР-СИНТАЗЫ ХЛОРОПЛАСТОВ

© 2009 г. А.С. Пронин, А.Н. Мальян*

Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290Пущино Московской обл., ул. Институтская, 2; факс: (496)733-0532, электронная почта: Malyan@ibbp.psn.ru

Поступила в редакцию 18.06.08 После доработки 03.10.08

Исследовано влияние пирофосфата (РР^) на включение меченых нуклеотидов в некаталитические центры АТР-синтазы хлоропластов. Установлено, что в условиях освещения тилакоидных мембран РР; конкурирует с нуклеотидами за связывание с некаталитическими центрами, в темноте способен прочно связываться с предварительно освобожденными от эндогенных нуклеотидов (вакантными) некаталитическими центрами, предотвращая последующее взаимодействие с этими центрами АБР и АТР. Изучено влияние РР; на кинетику гидролиза АТР. При микромолярных концентрациях АТР в темноте РР1 ингибировал АТРазную активность АТР-синтазы. Включение РР; в реакционную среду на стадии предварительного освещения подавляло высокую начальную активность фермента, но стимулировало его активность при более длительной инкубации. На основании анализа полученных данных сделан вывод, что стимулирующее действие РР; на АТ-Разную активность в результате световой преинкубации с тилакоидными мембранами обусловлено его связыванием с некаталитическими центрами АТР-синтазы. Ингибирование АТР-синтазы обусловлено конкуренцией РР; и АТР за связывание с каталитическими центрами.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: АТР-синтаза, СР0СРЬ сопрягающий фактор СРЬ некаталитические центры, хлоро-пласты.

АТР-Синтаза тилакоидных мембран хлоропластов (CFoCFj) катализирует фотосинтетическое фосфорилирование ADP за счет генерируемой при освещении трансмембранной разности электрохимических потенциалов протонов (Ацн+). Подобно АТР-синтазам митохондрий и бактерий, она состоит из периферической водорастворимой части (CF^ и мембранной части (CF0). Сопрягающий фактор хлоропластов CFj включает в себя по одной субъединице у, 8 и в и по три субъединицы а и в, на границах раздела которых расположены три каталитических и три некаталитических нуклеотидсвязывающих центра [1, 2]. В темноте АТР-синтаза неактивна. После предварительного освещения в присутствии тиоловых соединений она приобретает способность катализировать в темноте гидролиз АТР, сопряженный с трансмембранным переносом протонов внутрь тилакоида [3]. Активация АТР-синтазы сопровождается освобождением ADP, прочно связанного с одним из каталити-

Принятые сокращения: ФМС — феназинметосуль-фат, ДТТ — дитиотреитол, ТХУ — трихлоруксусная кислота; СР0СР1 — АТР-синтаза хлоропластов.

* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.

ческих центров [4, 5]. Активное состояние нестабильно: снижение трансмембранного градиента протонов, вызываемое выключением света или введением разобщителей, приводит к медленной инактивации фермента. Инактивация сопровождается связыванием ADP [6, 7]. Изолированные сопрягающие факторы различного происхождения ввиду отсутствия источника энергии проявляют только АТРазную активность. Их активация/инактивация сопровождается аналогичными процессами диссоциации/связывания ADP [8—10] с той лишь разницей, что активация вызывается высокими концентрациями АТР или оксианионами [10—13].

В начале 1990-х гг. было обнаружено, что условием активации АТРазных свойств сопрягающих факторов хлоропластов, митохондрий и бактерий является связывание АТР на некаталитических центрах [14, 15], способствующее диссоциации ADP, прочно связанного на одном из каталитических центров [16—18]. Представлены доказательства того, что вызывающие аналогичный эффект оксианионы также взаимодействуют с некаталитическими центрами [19]. Значительно меньше информации получено о роли некаталитических центров в функционирова-

нии АТР-синтаз. В определенной мере это обусловлено отсутствием до недавнего времени метода количественной оценки связывания нукле-отидов с некаталитическими центрами, а также тем, что нуклеотидсвязывающие свойства АТР-синтаз и закономерности процессов синтеза и гидролиза АТР существенно отличаются от проявляемых Fj-АТРазами. Так, ингибирование гидролиза АТР АТР-синтазой тилакоидных мембран хлоропластов требует на порядок более высоких концентраций MgADP [20]. Азид натрия, стабилизирующий неактивное состояние F1-АТРаз, практически не влияет на процессы окислительного и фотофосфорилирования, катализируемого АТР-синтазами [21, 22]. Три некаталитических центра АТР-синтазы хлороп-ластов сильно различаются по нуклеотидсвязы-вающим свойствам в отличие от соответствующих центров CF1-ATPазы [23].

Отмечаются также определенные аналогии в действии АТР и оксианионов на растворимый и связанный с мембраной фермент. Показано, что анион сульфита — один из наиболее эффективных оксианионов, стимулирующий F1-АТРазы различного происхождения, — активирует АТР-синтазу хлоропластов [24]. Преинкубация тила-коидных мембран на свету в присутствии АТР стимулирует их АТРазную активность в последующей темновой фазе [25]. Оксианионы фосфата и PP¡ стабилизируют индуцированную светом АТРазную активность АТР-синтазы в темноте [6, 26]. Исследования взаимодействия PP¡ с изолированными сопрягающими факторами различного происхождения выявили ряд особенностей, которые делают его интересным инструментом для изучения механизма регуляции активности АТР-синтазы. По своей структуре, включающей в себя фосфодиэфирную связь, PPj ближе к ADP и АТР, чем к неорганическому фосфату. Структурное подобие подтверждается близкими энергиями гидролиза АТР и PPj [27]. Подобно нуклеотидам и в отличие от других оксианионов PP¡ прочно связывается с F1-ATPазами [28—33]. При этом одни авторы приводят доказательства взаимодействия PP¡ с каталитическими центрами [32], тогда как другие применительно к ферментам митохондри-ального и бактериального происхождения отмечают высокую избирательность взаимодействия PPj с некаталитическими центрами [34, 35]. Наконец, в работе [36] приводятся доказательства связывания азидопроизводного меченого пиро-фосфата с аминокислотными остатками, принадлежащими к обоим типам центров. PP¡ содержится в строме хлоропластов и, следовательно, может влиять на активность АТР-синтазы in vivo [37].

Цель настоящей работы — изучить взаимодействие PPj с нуклеотидсвязывающими центрами АТР-синтазы тилакоидных мембран и выяснить возможное участие некаталитических центров в стабилизации ее АТРазной активности.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Тилакоидные мембраны хлоропластов выделяли из листьев гороха по методике Семеновой с соавт. [38] в модификации, описанной нами ранее [39]. Концентрацию хлорофилла определяли методом Арнона [40]. Тилакоидные мембраны активировали освещением белым светом интенсивностью 560 Вт/м2 в течение 5 мин. Для предотвращения нагрева образцов использовали фильтр СЗС-27. Активацию проводили в среде, содержавшей 20 мМ Tricine-KOH (рН 7,8), 0,2 М сахарозы, 20 мМ KCl и 1 мМ MgCl2 (ТСКМ-бу-фер), а также 50 мкМ феназинметосульфат (ФМС), 10 мМ ДТТ и 0,2 мг/мл хлорофилла. Для удаления эндогенных нуклеотидов за 0,5 мин до окончания активации среду разбавляли 5—10 объемами ТСКМ-буфера. Мембраны осаждали центрифугированием и ресуспендировали при конечной концентрации хлорофилла 1—2 мг/мл. Связывание нуклеотидов с АТР-синтазой тила-коидных мембран проводили при комнатной температуре в темноте или при освещении белым светом (560 Вт/м2) в среде объемом 0,7—1,4 мл, содержавшей [a-32P]ATP, ТСКМ-буфер, 50 мкМ ФМС и 100—200 мкг/мл хлорофилла. Пирофос-фат вводили в виде магниевого комплекса. Избирательное удаление меченых нуклеотидов из каталитических центров осуществляли описанным ранее методом («cold chase»), модификация которого включает в себя катализируемую ферментом замену меченых нуклеотидов на немеченые [39]. С этой целью к реакционной среде добавляли 0,1 объема раствора, содержавшего 22 мМ ATP, 0,66 M KHSO3, pH 7,8, 50 мкМ диаденозин-пентафосфат и 50 мкМ грамицидин D. Через 2 мин смесь центрифугировали в течение 1 мин при 10 000 g. Свободные нуклеотиды удаляли трехкратной промывкой осадка центрифугированием в буфере (50 мМ Tricine-KOH, pH 7,8, 0,2 M сахароза, 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl2) и последующим ресуспендированием осадка в 90 мкл этого буфера. Полученную суспензию (20—40 мкл) использовали для определения хлорофилла, остальную часть — для экстракции нуклеотидов 0,5 М HClO4 с последующей нейтрализацией КОН. После разделения меченых нуклеотидов методом тонкослойной хроматографии определяли содержание нуклеотидов по радиоактивности соответствующих пятен.

Скорость темнового гидролиза при низких концентрациях АТР определяли по изменению содержания [a-32P]ATP и [a-32P]ADP в реакционной среде.

Светоиндуцируемый гидролиз АТР измеряли потенциометрически стеклянным электродом [41]. Реакцию проводили в термостатируе-мой кювете при 20° в реакционной среде объемом 5 мл, содержавшей 2 мМ Tricine-KOH (pH 7,8), 0,2 М сахарозы, 100 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 0,05 мМ ФМС и тилакоидные мембраны (20 мкг хлорофилла на 1 мл). Тилакоидные мембраны восстанавливали ДТТ, как описано выше, исключив стадию удаления эндогенных нуклеоти-дов. После двухминутной активации тилакоид-ных мембран освещением белым светом интенсивностью 500 Вт/м2 выключали свет и инициировали реакцию гидролиза введением 0,5 мМ АТР и 1 мМ NH4Cl. При варьировании концентрации пирофосфата применяли его магниевый комплекс. В силу высокой стабильности комплекса [42] это позволяло исключить влияние добавок на изменение буферности среды и концентрации свободного магния. Особенности опытов отмечены в подписях к рисункам.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Взаимодействие PPi с некаталитическими центрами оценивали по снижению прочного связывания с этими центрами меченых ADP и АТР. Целесообразность такого методического подхода определялась тем, что по литературным данным [43] единственным ферментом хлороп-ластов, прочно связывающим нуклеотиды, является АТР-синтаза, тогда как в отношении PPi такие данные отсутствуют. Некаталитические центры АТР-синтазы предварительно освобождал

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком