ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 431, № 1, с. 132-135
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.322.23
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛИ(ADP-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 С АПУРИНОВЫМИ/АПИРИМИДИНОВЫМИ САЙТАМИ
© 2010 г. С. Н. Ходырева, Е. С. Ильина, М. М. Кутузов, М. В. Суханова, член-корреспондент РАН О. И. Лаврик
Поступило 22.09.2009 г.
Апуриновые/апиримидиновые (АР) сайты возникают за счет спонтанного или катализируемого ДНК-гликозилазами гидролиза N-глико-зидной связи между дезоксирибозой и основанием в эксцизионной репарации оснований (ЭРО); частота их возникновения в клетках млекопитающих составляет 104 событий в сутки [1]. Нерепа-рированные АР-сайты цитотоксичны и мутаген-ны [2], поэтому представляет значительный интерес идентификация белков млекопитающих, взаимодействующих с АР-сайтами и, возможно, участвующих в регуляции их репарации.
Впервые установлена способность поли(АЭР-рибозо)полимеразы 1 (PARP1) — регуляторного белка процесса ЭРО — взаимодействовать с АР-сайтами с формированием основания Шиффа. PARP1 была идентифицирована в составе кова-лентного аддукта, образованного линейной АР-ДНК в экстракте семенников крупного рогатого скота (СКРС) пептидным картированием на основе данных матричной лазерной десорбционной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI— TOF—MS). Показано, что рекомбинантная PARP1 не расщепляет АР-сайты по механизму р-элими-нирования и ингибирует гидролиз АР-сайтов АР-эндонуклеазой 1 (АРЕ1), если напротив него находится аналог АР-сайта — остаток 2-гидрокси-метил-3-гидрокситетрагидрофурана (THF), т.е. если АР-сайт входит в состав множественного повреждения.
Остатки дезоксирибозы в AP-сайтах находятся в равновесии циклической фуранозной и ациклической альдегидной форм. Альдегидные группы АР-ДНК могут реагировать с первичными аминогруппами белков, образуя основания Шиффа. В частности, основание Шиффа с s-аминогруппа-ми лизинов является промежуточным соединением, образуемым некоторыми ферментами ЭРО в процессе катализа [3, 4]. Образование основания
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской Академии наук, Новосибирск
Шиффа — обратимый процесс, однако связь белка с ДНК можно стабилизировать за счет восстановления боргидридом натрия [4—8]. Наряду с фотоаффинной модификацией такой способ ковал ентного присоединения белков к нуклеиновой кислоте часто применяют в исследовании белок—нуклеиновых взаимодействий [5—9].
PARP1 — высококопийный полифункциональный ядерный белок высших эукариот с молекулярной массой 113 кДа. Связываясь с одно- и двухцепочечными (ДЦ) разрывами ДНК, PARP1 активируется и катализирует синтез из NAD+ полимера ADP-рибозы, ковалентно присоединенного к ряду белков, участвующих в метаболизме ДНК, в том числе к PARP1 [10]. Считают, что по-ли(ADP-рибоза), PAR, — разветвленный отрицательно заряженный полимер — вызывает диссоциацию комплекса белок—ДНК, обеспечивая доступ ферментов репарации к месту повреждения ДНК [10]. Согласно альтернативной точке зрения, PAR служит сигналом для привлечения ферментов репарации к месту повреждения ДНК [10]. Действительно, некоторые белки — участники процесса репарации — содержат специфические мотивы для связывания PAR [10].
Ранее нами с использованием экстрактов клеток человека и линейных ДНК-дуплексов (32 н.п.), содержащих АР-сайты в середине радиоактивно меченной цепи, было показано, что Ки80-субъеди-ница Ku-антигена обладает способностью формировать основание Шиффа с АР-сайтами [7, 8]. Ku-антиген — регуляторный белок репарации ДЦ-разрывов — обладает высоким сродством к ДЦ-концам [11]. Он представлен в клетках высших эукариот, в особенности приматов, большим числом копий [11], что в сочетании с высоким сродством к ДЦ-концам обусловливает эффективную конкуренцию Ku-антигена с другими ДНК-связы-вающими белками экстрактов при взаимодействии с линейными ДНК. Чтобы избежать конкуренции Ku-антигена при поиске белков, взаимодействующих с АР-сайтами, были использованы кольцевые ДНК, содержащие случайно распределенные АР-сайты в одной из цепей. Кольцевые ДНК, содержащие остатки урацила, синтезировали с при-
ВЗАИМОДЕИСТВУИЕ ПОЛИ(АБР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1
(a)
133
1 2 3 4 5
кДа
12095"
PARP1 -Ku80
12 3
кДа
120 — 95-
-PARP1-(ADF)„ PARP1
MgCl2 -
NAD
+
Рис. 1. Анализ продуктов сшивки АР-ДНК с белками различных экстрактов. Дорожки 1—4 соответствуют образцам, полученным с использованием кольцевой АР-ДНК в цельноклеточных экстрактах НеЬа, фиб-робластов человека (ФЧ), МСБ-7 и ядерном экстракте СКРС соответственно. На дорожке 5 представлен контрольный образец сшивки белков в экстракте НеЬа с 32-мерной линейной АР-ДНК (без обработки нуклеазой).
менением одноцепочечной ДНК фага М13 с тремя праймерами, расположенными на приблизительно равных расстояниях друг от друга. Синтез ДНК осуществляли с использованием фрагмента Штоффеля Тад ДНК-полимеразы в присутствии природных дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов, ШТР, [а-32Р]-ёЛТР, АТР и термофильной ДНК-лигазы МеШапоЪа^егшт ЛегтоаиШ^орЫсит. Превращение одноцепочечной ДНК в ДЦ подтверждали рестрикционным анализом. АР-сайты получали непосредственно перед экспериментом, удаляя остатки урацила урацил-ДНК-гликозила-зой. Белки экстракта инкубировали с АР-ДНК и после восстановления боргидридом обрабатывали эндонуклеазой для удаления ДНК, выступающей за пределы белковых глобул, затем продукты сшивки ДНК—белок анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях.
Для М13 ЛР-ДНК во всех экстрактах основные продукты сшивки с одной и той же электрофоре-тической подвижностью соответствуют белку с кажущейся молекулярной массой более 110 кДа (рис. 1, дорожки 1—4). Белок в составе продукта сшивки в случае линейной АР-ДНК и экстракта НеЬа (рис. 1, дорожка 5) был идентифицирован как Ки80-субъединица Ки-антигена [7, 8]; следовательно, вновь обнаруженные продукты для кольцевой ДНК едва ли связаны с этим белком. Это абсолютно ожидаемый результат, поскольку для эффективного связывания Ки-антигена с
(б)
кДа
120— 95-
12 3
PARP1-(ADF)„ PARP1
МЕС12 - + +
МЛБ+- - +
Рис. 2. Автополи(ЛОР-рибозил)ирование рекомби-нантной PAR.P1, ковалентно присоединенной к АР-ДНК. а — сшивка PARP1 с линейной АР-ДНК. б — сшивка PARP1 с кольцевой АР-ДНК.
ДНК необходимы концы, преимущественно ДЦ [11].
Мы предположили, что продукты сшивки, образуемые М13 АР-ДНК, относятся к PARP1. С использованием индивидуальной рекомби-нантной PARP1 установлено, что этот белок способен образовывать сшивки с линейной АР-ДНК (рис. 2а, дорожки 1 и 2) и кольцевой АР-ДНК (рис. 2б, дорожки 1 и 2). При замене в структуре линейной АР-ДНК АР-сайта на его аналог — остаток THF — или без восстановления боргидридом натрия продукты сшивки ДНК—белок не обнаружены (данные не проиллюстрированы). Это согласуется с предположением, что образование ковалентных аддуктов PARP1 с АР-ДНК опосредовано образованием основания Шиффа.
Ранее нами было установлено, что PARP1, ко-валентно присоединенная к фотоактивной ДНК, способна подвергаться поли(ADP-рибозил)иро-ванию с образованием продуктов, имеющих бо-
134
ХОДЫРЕВА и др.
HeLa СКРС HeLa СКРС
1 23 45 6 78 9101112
кДа
12095-
MgCl2 -NAD+ -
■ PARP1-(ADP)„
PARP1
Ku80
Рис. 3. Автополи(ЛОР-рибозил)ирование РЛКР1 экстрактов НеЬа и СКРС, ковалентно присоединенной к АР-ДНК. Дорожки 1—6 — сшивка белков экстрактов с кольцевой АР-ДНК и дорожки 7—12 — с линейной АР-ДНК.
лее низкую электрофоретическую подвижность, что позволяет идентифицировать в экстрактах продукты, относящиеся к PARP1, среди других сшивок белок—ДНК [9]. С использованием ре-комбинантной PARP1 была оценена применимость такого подхода в случае ковалентных ад-дуктов PARP1 с АР-ДНК. Образование продуктов со сниженной электрофоретической подвижностью означает (рис. 2а, дорожка 3 и рис. 2б, дорожка 3), что PARP1, ковалентно присоединенная к АР-ДНК, может подвергаться поли^ЭР-рибозил)ированию. Следовательно, этот подход, как и в случае фотоактивных ДНК, можно применять для дискриминации продуктов, относящихся к PARP1.
Действительно, в обоих экстрактах в присутствии NAD+ наблюдается появление продуктов, имеющих более низкую электрофоретическую подвижность, с одновременным уменьшением количества исходных продуктов сшивки, относимых нами к PARP1 (сравнить рис. 3, дорожки 1, 2, 4, 5, 10, 11 и дорожки 3, 6, 12). Продукты сшивок линейных АР-ДНК с белками в экстракте клеток НеЬа (рис. 3, дорожки 7—9) были ранее идентифицированы нами как относящиеся к Ки80-субъ-единице Ки-антигена [7, 8]. В экстракте СКРС такие продукты отсутствуют, а аддукты, относимые к PARP1, являются преобладающими, поэтому этот экстракт более предпочтителен для дальнейших экспериментов по идентификации белка.
Идентичность белка в составе ковалентного аддукта с АР-ДНК была подтверждена методом пептидного картирования на основе данных масс-спектрометрии с импользованием разработанной нами ранее процедуры [7, 8] и экстракта СКРС. Для выделения продуктов сшивки АР-ДНК—белок использовали линейную АР-ДНК, содержащую остатки биотинилирован-ного dUMP, что обеспечивает специфическую адсорбцию целевого продукта на сорбенте с иммобилизованным стрептавидином. После дополнительной очистки электрофорезом в ПААГ целевой продукт локализовали по совпадению положения белковой полосы (окрашенной Ку-масси R250) и радиоактивной метки, входящей с состав ДНК. Затем белок непосредственно в геле подвергали исчерпывающему трипсинолизу. Пептиды после экстракции из геля анализировали с помощью MALDI—TOF—MS. Поиск белка осуществляли в базе данных NCBI с использованием алгоритма MASCOT и опции "other mammals". PARP1 была идентифицирована как наиболее достоверный кандидат (Mowse score 248, coverage 38%).
Представляло интерес оценить возможные каталитические функции PARP1 в отношении АР-сайтов. Поскольку основание Шиффа является интермедиатом при расщеплении АР-сайтов бифункциональными ДНК-гликозилазами по механизму р-элиминирования [1, 2, 4], была проверена способность PARP1 расщеплять сахарофос-фатный остов ДНК по положению АР-сайта. Однако даже при стехиометрическом отн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.