научная статья по теме ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РАСТЕНИЙ С АССОЦИАТИВНЫМИ БАКТЕРИЯМИ ПРИ ЗАГРЯЗНЕНИИ ПОЧВЫ ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РАСТЕНИЙ С АССОЦИАТИВНЫМИ БАКТЕРИЯМИ ПРИ ЗАГРЯЗНЕНИИ ПОЧВЫ ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 78, № 6, с. 826-835

= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =

УДК 631.6:575.17:632.15

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РАСТЕНИЙ С АССОЦИАТИВНЫМИ БАКТЕРИЯМИ ПРИ ЗАГРЯЗНЕНИИ ПОЧВЫ ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ

© 2009 г. В. Н. Пищик*, Н. А. Проворов**, Н. И. Воробьев**' Е. П. Чижевская**, В. И. Сафронова**, А. Н. Туев***, А. П. Кожемяков**

*Инновационно-производственная компания ООО "Бисолби-Интер" при ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии Росселъхозакадемии, Пушкин **Государственное научное учреждение Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии

Росселъхозакадемии, Пушкин ***ГНУ Всероссийский НИИ защиты растений Росселъхозакадемии, Пушкин Поступила в редакцию 18.08.2008 г.

Изучено взаимодействие бактерий Bacillus subtilis и Pantoea agglomerans с растениями овса (Avena sativa) на почвах, загрязненных тяжелыми металлами (ТМ) - кадмием (50 мг/кг) и свинцом (200 мг/кг). Добавление ТМ вызывает снижение длины и массы растений на 30-50%, а также соотношения размеров надземной и корневой части. Внесение бактерий обеспечивает не только восстановление продуктивности растений, но и ее превышение над уровнем, достигаемым при инокуляции бактериями овса в незагрязненной почве, а также снижение накопления растениями ТМ. Чистые культуры P. agglomerans накапливают ТМ более активно, чем B. subtilis (адсорбирующая активность изучена как для клеток, так и внеклеточных метаболитов). При внесении бактерий в почву содержание в ней свинца снижается в 4-5 раз, кадмия в 2-3 раза. Защита растений от ТМ может быть связана с закономерными реорганизациями бактериальных популяций прикорневой зоны: их численности возрастают в ризоплане, но снижаются в ризосфере.

Ключевые слова: микробно-растительные ассоциации, ризосферные рост-стимулирующие бактерии (PGPR - Plant Growth Promoting Rhizobacteria), тяжелые металлы (ТМ), микробиологическая защита растений от стрессов, ризосфера, ризоплана.

Одним из наиболее эффективных приемов снижения воздействия тяжелых металлов (ТМ) на растения является их инокуляция ризосферными рост-стимулирующими бактериями (PGPR - Plant Growth Promoting Rhizobacteria) [1-3]. Эффективные механизмы защиты растений от ТМ реализуются в рамках широкого комплекса симбиотических взаимодействий, осуществляемых в прикорневой зоне: бактерии улучшают питание растений (фиксация N2, мобилизация нерастворимых соединений фосфора), стимулируют образование у них стресс-специфичных белков, усиливают образование органо-мине-ральных комплексов в почве [2, 4-8]. Поэтому в условиях интоксикации ТМ использование биопрепаратов, содержащих PGPR, позволяет существенно повысить продуктивность всех основных (зерновые, овощные, кормовые, технические) сельскохозяйственных культур [9-11]. В то же время, закономерности формирования микробных сообществ прикорневой зоны в условиях интоксикации ТМ остаются мало изученными.

1 Адресат для корреспонденции (e-mail: vorobyov@arriam.spb.ru).

Ранее мы [12, 13] на основании результатов математического моделирования предположили, что повышение устойчивости растений к ТМ при инокуляции PGPR может быть сопряжено со значительными изменениями пространственной структуры их популяций в прикорневой зоне. Целью настоящих исследований была проверка этого предположения, направленная на изучение популяционных и физиологических механизмов адаптации ассоциативной системы к стрессовым воздействиям. Для этого изучена численность двух видов PGPR (Pantoea agglomerans, Bacillus subtilis) в ризосфере и ризоплане овса при загрязнении ТМ и сопоставлено влияние инокуляции на продуктивность растений со способностью бактерий адсорбировать ТМ в почвах и чистой культуре.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучаемые бактерии, идентифицированные ранее с использованием методов нумерической таксономии как Bacillus subtilis (штамм 413) и Klebsiella mobilis (штамм 880), получены из коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии [14]. На основе штамма 413 производится препарат экстрасол,

обладающий рост-стимулирующими и фитопротек-торными свойствами [15]. Штамм 880 оказался перспективным для создания биопрепарата мобилин, показавшего высокую эффективность при испытании в Географической Сети ВНИИСХМ [11, 16-17].

Бактерии культивировали в среде ДАС (среда Деберейнер) следующего состава (г/л дистиллированной воды): K2HPO4 - 0.1; KH2PO4 - 0.4; MgSO4 - 0.2; NaCl - 0.1; CaCl2 - 0.02; FeCl3 - 0.01; Na2MoO4 - 0.002; яблочная кислота - 2.5; сахароза - 1; глюкоза - 1; дрожжевой экстракт - 1; pH 6.6.

Определение содержания свободных ионов кадмия и свинца в образцах проводили с использованием ион-селективных электродов (IS-Cd, IS-Pb), определение общего количества ТМ в растениях и иммобилизацию ТМ чистыми культурами бактерий - с помощью атомно-адсорбционного спектрофотометра Perkin-Elmer (HGA74). При изучении адсорбции ТМ чистыми культурами бактерий их выращивали на агаризованной питательной среде TSA [18] 48 ч при 25°С, суспендировали в дистиллированной воде (106 кл/мл) и 0.1 мл суспензии вносили во флаконы с 20 мл среды ДАС с добавлением Pb(NO3)2 (0-5 мМ Pb) или CdCl2 (0-2 мМ Cd). Флаконы с культурами инкубировали при 25°С 48 ч в пяти повторностях. Бактериальные клетки были центрифугированы, дважды промыты в 0.8% NaCl и ресуспендированы в 5 мл 0.8% NaCl [19]. Затем была измерена концентрация металлов в биомассе и супернатанте.

Численность бактерий, колонизирующих ризосферу, определяли на единицу площади фильтра [20], а численность бактерий в ризоплане - на единицу массы корней. В обоих случаях производили высев на селективную агаризованную среду ДАС, содержащую налидиксовую кислоту (50 мг/л), поскольку в качестве контроля были использованы спонтанные мутанты изученных штаммов, устойчивые к этому антибиотику.

Бактерии наносили на мембранные фильтры в виде суспензии вегетативных клеток с титром 106 КОЕ/мл. Семена овса (Avena sativa) сорта Борус укладывали на фильтры, оборачивали синтетической тканью (она защищает семена и фильтр от механических повреждений, но не препятствует миграции бактерий и диффузии почвенных растворов) и помещали в почву. В начальный момент и через определенные промежутки времени фильтры извлекали из почвы и проводили анализ численности бактерий-интродуцентов после смыва с поверхности фильтра (ризосфера) или корней (ризоплана) методом предельных разведений и посева на селективную среду (повторность 5-кратная).

Вегетационные опыты были проведены в пленочных теплицах при естественном освещении. В опытах использовали сосуды, содержащие по 0.5 кг дерново-подзолистой почвы (общий азот -0.1%; K2O - 2.8 мг/100 г, углерод по Тюрину - 0.79%, гумус - 1.36%, гидролитическая кислотность -12.05 мг-экв/100 г, pHKCl 5.4). Удобрения вносили перед закладкой опыта (мг/кг почвы): NH4NO3 - 25; K2HPO4 - 80; MgSO4 - 15; ZnSO4 - 1; CuSO4 - 1; H3BO3 - 1; Na2MoO4 - 0.5. Свинец в виде Pb(NO3)2 вносили в концентрации 200 мг/кг почвы, кадмий в виде CdCl2 - 50 мг/кг почвы (эти концентрации соответствуют 10 ПДК [21].

Для математической обработки данных использовали дисперсионный анализ и t-критерий Стьюдента.

Для идентификации бактериальных штаммов на основании анализа последовательности генов 16S рРНК выделение геномной ДНК проводили по общепринятой методике SDS-лизиса с протеиназой К

[22]. Фрагменты геномов изучаемых штаммов, содержащие последовательности генов 16S рРНК, были амплифицированы с использованием универсальных праймеров fD1: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCT-CAG-3' и rD1: 5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'

[23]. ПЦР-фрагменты, размером около 1500 п.н., были выделены из агарозного геля с использова-ним набора Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System ("Promega", США) и клонированы в составе Т-вектора pTZ57R/T ("MBI Fermentas", Литва). Нук-леотидные последовательности были определены на автоматическом секвенаторе ABI Prism 377XL с использованием набора ABI Prism BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit и стандартных праймеров M13for(-20) и M13rev(-26) по методике фирмы-изготовителя ("Applied Biosystems", США). Сравнение нуклеотидных последовательностей осуществляли с использованием программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) [24], базы данных Bio Informatic Bacteria Identification (Bibi) Data Bases (http://umr5558-mq1.univ-lyon1.fr/qm7page = BibiDa-taBases) и базы данных Ribosomal Database Project II (http://rdp.cme.msu.edu).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Видовая идентификация бактерий. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК (200-500 п.н.) штамма 880 подтвердил его принадлежность к семейству Enterobacteriaceae. При этом максимальное (100%) сходство было обнаружено со штаммом B1 Pantoea agglomerans (номер доступа в GeneBank

Таблица 1. Влияние инокуляции B. suЫШs и P. agglomerans на длину растений овса (мм) в зависимости от внесения тяжелых металлов (ТМ)

Варианты 3-дневные проростки Стебли 20-дневных растений Корни 20-дневных растений

Контроль (без ТМ и бактерий) 8.0 160 171

Контроль + P. agglomerans 11.0 (+) 215 (+) 230 (+)

Контроль + B. subtilis 10.5 (+) 205 (+) 218 (+)

Cd 3.2 (-) 135 (-) 157 (-)

Cd + P. agglomerans 9.4 (+) 174 (+) 193 (+)

Cd + B. subtilis 8.9 (+) 168 (+) 190 (+)

Pb 5.6 (-) 154 (-) 167

Pb + P. agglomerans 10.8 (+) 210 (+) 235 (+)

Pb + B. subtilis 10.1 (+) 198 (+) 217 (+)

НСР0.05 0.8 6 10

Примечание. (+) и (-) - достоверные отклонения от контроля без внесения ТМ или бактерий.

DQ133596), хотя ранее [14] он был идентифицирован как Klebsiella mobilis.

Для штамма 413 подтверждена принадлежность к семейству Bacillaceae и максимальное (100%) сходство обнаружено с рядом штаммов Bacillus subtilis, например, со штаммом ZJ06 (номер доступа в GeneBank EU26607), что совпадает с результатами его нумерической идентификации.

Развитие растений при инокуляции бактериями и воздействии ТМ. Результаты вегетационных опытов показали, что внесение в почву ТМ ингибирует развитие овса, что выражается в уменьшении длины и массы растений (табл. 1; рис. 1, 2а), причем кадмий проявил большую токсичность по сравнению со свинцом. Развитие надземной части при воздействии ТМ ингибируется в большей степени, чем раз-

и £

Я

щ

н о

С

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»