МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 5, с. 900-905
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 577.216.35
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РИБОСОМНОГО БЕЛКА 826 ЧЕЛОВЕКА С ФРАГМЕНТАМИ мРНК И ПРЕ-мРНК ЭТОГО БЕЛКА В ЯДЕРНОМ ЭКСТРАКТЕ КЛЕТОК ИеЬа
© 2003 г. А. В. Иванов, А. А. Малыгин, Г. Г. Карпова*
Новосибирский институт биоорганической химии Сибирского отделения Российской академии наук,
Новосибирск, 630090 Поступила в редакцию 03.03.2003 г.
Методом фильтрования на нитроцеллюлозных фильтрах с использованием РНК, полученных с помощью транскрипции различных фрагментов гена рибосомного белка 826 человека (гр526), показано, что рекомбинантный гр826 связывается с первым интроном пре-мРНК (кажущаяся константа ассоциации (Ка) ~ 5.0 х 107 М-1) и в меньшей степени с фрагментом мРНК (Ка ~ 2.0 х 107 М-1). О специфичности связывания гр826 с этими РНК свидетельствует тот факт, что Ка другого рекомбинант-ного рибосомного белка человека, 819 (гр819), с первым интроном на порядок ниже, чем Ка гр826, а связывания гр819 с фрагментом мРНК грБ26 практически не происходит. С помощью антител, специфичных к гр826, показано, что этот белок в составе ядерного экстракта клеток ИеЬа также связывается с первым интроном своей пре-мРНК и, в меньшей степени, с фрагментом своей мРНК. В обоих случаях количество связавшихся РНК значительно увеличивается при добавлении в ядерный экстракт рекомбинантного гр826. Результаты работы позволяют заключить, что гр826, наряду с другими белками ядерного экстракта (с молекулярными массами 48 и 59 кДа), найденными ранее, участвует в образовании комплексов с пре-мРНК грБ26, функциональная роль которых, возможно, заключается в том, что в них хранятся пре-мРНК, неактивные в сплайсинге.
Ключевые слова: рибосомный белок 826 (гр826) человека, мРНК, пре-мРНК, рекомбинантный гр826, антитела к гр826, взаимодействия рибосомных белков с РНК, ядерный экстракт клеток ИеЬа.
Известно, что рибосомные белки обладают функциями, не связанными с процессом трансля-циии. Например, рибосомный белок 83 крысы является апурин/апиримидиновой эндонуклеазой и участвует в репарации ДНК [1], а белки Ь5 [2], Ь18 [3], Ь34 [4] и Ь41 [2] могут связываться с различными протеинкиназами и ингибировать их активность. Кроме этого, некоторые рибосомные белки участвуют в процессах, связанных с апоп-тозом. Так, изменение уровня экспрессии генов рибосомных белков 83а [5] и Ь7 [6] вызывает апоптоз клеток, а сверхэкспрессия рибосомного белка Ь35а, наоборот, предотвращает клеточную гибель [7]. При апоптозе клеток 1игка1 некоторые рибосомные белки секретируются на внешнюю клеточную мембрану и, как предполагают, служат мишенями для фагоцитов [8]. Имеется также много данных о сверхэкспрессии генов рибосомных белков при злокачественной трансформации клеток человека. В частности, при раке толстой
Принятые сокращения: rpS19 и rpS26 - рибосомные белки S19 и S26 (от ribosomal protein); 5'-UTR - 5'-нетранслируе-мая область (от untranslated region) мРНК; SDS - додецил-сульфат натрия; DTT - дитиотреит; EDTA - этилендиамин-тетрауксусная кислота; Ка - кажущаяся константа ассоциации.
* Эл. почта: кarpova@niboch.nsc.ru
кишки наблюдается сверхэкспрессия генов белков 83, 86, 88, 812, Р0, Ь5 [9], при раке предстательной железы - Ь7а, Ь37 [10], при опухоли головного мозга - Ь19 [11]. Некоторые рибосомные белки, а именно, Р0/Р1/Р2 [12], 810 [13], Ь12 [14] и Ь14 [15], являются аутоантигенами при заболевании системной красной волчанкой.
Полифункциональность рибосомных белков находит свое отражение в сложной и многоуровневой системе регуляции экспрессии их генов, которая может происходить на любом этапе синтеза белка. В настоящее время имеется достаточно много данных о регуляции синтеза рибосомных белков в клетке на стадиях трансляции и транскрипции (см., например, [16, 17]). Значительно меньше известно о регуляции сплайсинга пре-мРНК рибосомных белков. К настоящему времени установлено, что рибосомные белки 814 [18] и Ь30 [19] 8ассНатотусв8 cerevisiae связываются со своими пре-мРНК в области 1-го интрона и тем самым ингибируют их сплайсинг. Кроме этого, показано, что уровень сплайсинга пре-мРНК рибосомного белка Ь1 Хепорш laevis зависит от степени экспрессии родственного белка в клетке [20].
Ранее мы показали, что с первым интроном пре-мРНК грБ26 связывается несколько рибосом-
ных белков, включая грБ26. Те же белки - в значительно меньшей степени - связываются с фрагментом мРНК трБ2б. Рибосомные белки не влияют на сплайсинг фрагмента пре-мРНК, содержащего первый интрон, второй экзон, второй интрон и часть третьего экзона, но повышают эффективность сшивки белков ядерного экстракта клеток ИеЬа с первым интроном [21].
В настоящей работе изучено связывание первого интрона пре-мРНК и фрагмента мРНК трБ2б с грБ26 человека. С помощью специфичных антител показано, что грБ26 в составе ядерного экстракта клеток ИеЬа также связывается с первым интроном своей пре-мРНК и, в меньшей степени, с фрагментом мРНК.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Использовали акриламид, ^№-метилен-бис-акриламид ("Fluka"), белок А-сефарозу ("Sigma"), BrCN-агарозу ("Pharmacia"), ядерный экстракт клеток HeLa ("4C"), РНКазин ("Promega"), ДНК-полимеразу I E. coli (фрагмент Кленова) ("СибЭн-зим", Новосибирск). РНК-полимераза фага Т7 (450000 ед.акт./мг) любезно предоставлена В.Н. Анкиловой (Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН). Олигодезоксирибо-нуклеотиды синтезированы в НИБХ СО РАН. [a-32P]-GTP (1000 Ки/ммоль) синтезирован Д.В. Семеновым (НИБХ СО РАН). Рекомбинантные rpS19 и rpS26 получены, как описано [22]. Линеаризованная плазмидная ДНК, содержащая 3'- и 5'-фланкирующие последовательности, Т7-про-мотор и последовательность, соответствующую первому интрону, второму экзону, второму ин-трону и части третьего экзона гена rpS26, а также кДНК rpS26 любезно предоставлены М.Л. Филипенко (НИБХ СО РАН). Антисыворотка против rpS26 получена, как описано [23].
Получение ДНК-матриц для транскрипции.
Матрицу для синтеза фрагмента пре-мРНК, соответствующего первому интрону, получали с помощью амплификации ДНК, содержащей 3'- и 5'-фланкирующие последовательности, Т7-промо-тор и последовательность, соответствующую первому интрону, второму экзону, второму интрону и части третьего экзона гена rpS26 человека, с использованием олигодезоксирибонуклеотидных праймеров: I1-F (5'-GGATCCTAATACGACTCAC-TATAGGGGTGAGTCTTCTTGCGTGGT-3') и I1-R (5'-CTGCGACAGGATGGGAAAAC-3'). Матрицу для синтеза фрагмента мРНК получали с помощью амплификации кДНК rpS26 с использованием олигодезоксирибонуклеотидных праймеров: I2-F (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGG CCTGTCTCCGGTCCGT-3') и m356 (5'-GACGTG GGGCAGCACCCGC-3').
Синтез РНК-транскриптов. Меченные 32Р фрагменты мРНК и пре-мРНК rpS26 получали с помощью транскрипции in vitro, используя соответствующие ДНК-матрицы, как описано ранее [21], за исключением того, что в качестве радиоактивного рибонуклеозидтрифосфата использовали [a-32P]GTP.
Связывание [32Р]-меченных транскриптов с рекомбинантными рибосомными белками S19 и S26 человека. Связывание РНК-транскриптов с рекомбинантными rpS19 и rpS26 человека проводили, как описано ранее [21], с небольшими изменениями. В частности, для связывания использовали 20 мМ буфер Трис-HCl, pH 7.5, содержащий 10 мМ MgCl2, 300 мМ КС1, 2.5 мМ 2-меркаптоэта-нол, 0.1%-ный Тритон Х-100 и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. РНК-транскрипты предынкубировали в этом же буфере в течение 30 мин при 37°С и затем охлаждали до 0°С. Степень связывания РНК-транскриптов определяли путем фильтрования комплексов на нитроцеллю-лозных фильтрах, как описано ранее [21]. Кажущуюся константу ассоциации (Ха) РНК с белками определяли как величину, обратную концентрации белка при половинном значении плато изотермы.
Выделение и анализ специфичных антител против rpS26. 100 мг BrCN-агарозы инкубировали в 1 мМ HC1 в течение 15 мин при 20°С, после чего промывали 0.1 М Na2CO3, pH 9.0. Активированную BrCN-агарозу инкубировали при перемешивании с 15.6 нмоль рекомбинантного rpS26 в течение 2 ч при 20°С. К раствору белка предварительно добавляли 0.1 М Na2CO3, pH 9.0, до конечного рН 8.5. Затем сорбент попеременно промывали 4 раза по 1 мл 0.1 М CH3COONa, рН 5.5, и 0.1 М Na2CO3, pH 9.0, оба буфера содержали 0.5 М NaCl. Полученный аффинный сорбент уровновешива-ли 100 мМ буфером Трис-HCl, рН 7.5, содержащим 150 мМ NaCl (буфер А), и инкубировали с 1 мл предварительно осветленной антисыворотки в течение 16 ч при 4°С. После этого сорбент промывали 2 мл 50 мМ буфера Трис-HCl, рН 7.5, содержащего 120 мМ NaCl и 0.5%-ный Нонидет P-40 (буфер Б), 2 мл 50 мМ буфера Трис-HCl, рН 7.5, содержащего 1.0 M LiCl и 0.5%-ный Нонидет Р-40, 4 мл буфера Б и 4 мл буфера А. Связавшиеся с сорбентом антитела элюировали 50 мМ буфером глицин-HCl, рН 2.5, содержащим 150 мМ NaCl. Очищенные антитела анализировали с помощью иммуноблотинга [23].
Связывание РНК-транскриптов с rpS26 в составе ядерного экстракта клеток HeLa. Связывание проводили при 0°С в течение 1 ч в 100 мкл 50 мМ буфера Трис-HCl, pH 7.5, содержащего 300 мМ NaCl, 1 мМ EDTA и 0.1%-ный Тритон Х-100 (буфер В). 15 мкл ядерного экстракта клеток HeLa предварительно инкубировали в течение 5 мин при 30°С в буфере В, а РНК-транскрипты (~0.5 фмол,
ИВАНОВ и др. Фрагмент мРНК
AUGC
*
\ . \
\
\
\
Ген р26
интрон
экзон
Первый интрон пре-мРНК
Рис. 1. Схематическое изображение гена тр826 человека и используемых в работе РНК, соответствующих фрагменту мРНК и первому интрону пре-мРНК (1-4 - номера экзонов).
1
2
4
3
4000 имп/мин) - 30 мин при тех же условиях. В определенных случаях к ядерному экстракту перед инкубацией добавляли 30 мкмоль рекомбинантно-го гр826. Антитела, специфичные к гр826, иммобилизовали на белок А-сефарозе, перемешивая 20 мг сорбента с 10 мкл антисыворотки в течение 2 ч при 0°С. Сорбент с иммобилизованными антителами промывали 5 раз по 1 мл буфера В и добавляли к смеси, содержащей предынкубированные РНК-транскрипты и белки ядерного экстракта клеток ИеЬа, смесь выдерживали в течение 1 ч при 0°С. Сорбент белокА-сефароза ■ антитело со связавшимс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.