МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 5, с. 893-899
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 577.311
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ Escherichia coli С ТАТА-СВЯЗЫВАЮЩИМ БЕЛКОМ ЭУКАРИОТ
© 2003 г. В. А. Pay, И. А. Драчкова, В. А. Pap1, А. А. Соколенко, Т. В. Аршинова,
В. Ф. Кобзев, Л. К. Савинкова*
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, 630090 Новосибирский институт биоорганической химии Сибирского отделения Российской академии наук,
Новосибирск, 630090 Поступила в редакцию 03.03.2003 г.
Изучали взаимодействие РНК-полимеразы E. coli, ее рекомбинантных полного и минимального ферментов и о-субъединицы, по отдельности, с ТАТА-связывающим белком (ТВР) эукариот. Показано, что в случае предынкубации полной РНК-полимеразы с ТВР в возрастающей концентрации и последующей инкубации с одинаковыми количествами фосфамидного производного ТАТА-со-держащего олигодезоксирибонуклеотида, меченного 32Р, по мере увеличения концентрации ТВР уменьшается количество ковалентных комплексов полного фермента с фосфамидным производным меченого олигодезоксирибонуклеотида. Эти данные косвенно свидетельствуют об образовании комплексов РНК-полимеразы с ТВР. С помощью метода задержки в геле показано, что, в отличие от полного фермента, ни минимальный фермент, ни о-субъединица РНК-полимеразы E. coli не взаимодействуют с ТВР: при одновременной инкубации в реакционной смеси образуются как комплексы минимального фермента или о-субъединицы, так и комплексы ТВР с меченым олиго-дезоксирибонуклеотидом. Эти результаты свидетельствуют о функциональном сходстве РНК-полимеразы E. coli с РНК-полимеразой II эукариот, а также о том, что для выполнения специфических функций субъединицы РНК-полимеразы E. coli должны находиться в ансамбле субъединиц полного фермента.
Ключевые слова: РНК-полимераза, минимальный фермент, полный фермент, субъединицы РНК-полимеразы, ТВР, олигодезоксирибонуклеотиды, белково-нуклеиновое взаимодействие, ковалент-ный комплекс.
Считывание генетической информации с молекулы ДНК осуществляют ДНК-зависимые РНК-полимеразы. У прокариот процесс транскрипции осуществляет, в основном, одна РНК-по-лимераза. Бактериальная РНК-полимераза (E. coli) имеет относительно простую структуру, которая состоит из четырех субъединиц - a^ß', образующих минимальный фермент, и пятой субъединицы - а, присоединение которой превращает минимальный фермент в полный фермент. а-субъединица определяет специфичность взаимодействия фермента с промотором [1]. У бактерий обнаружено семь разных субъединиц, относящихся к двум основным семействам - а70 и а54. Присоединение той или иной а-субъединицы к одному и тому же минимальному ферменту приводит к образованию полных ферментов с различными свойствами [2]. а70 - главная субъединица семейства, участвующая в экспрессии большинства генов во время экспоненциальной фазы роста [3].
Принятые сокращения: ТЭАБ - бикарбонат триэтиламмо-ния, ПААГ - полиакриламидный гель.
* Эл. почта: savsok@niboch.nsc.ru
Ранее установлено, что Р-субъединица содержит участок связывания субстратов и ДНК, а функция Р'-субъединицы заключается в связывании с ДНК-матрицей [1]. В более поздних работах с помощью метода высокоизбирательного аффинного мечения обнаружено, что на а2Р и на изолированной Р-субъединице расположен пурин-специфический участок инициации транскрипции [4]. В других работах [5, 6] показано, что с несколькими областями Р-субъединицы инициирующий субстрат интенсивно контактирует. В работе Кузнеделова и соавт. [7] показано, что на Р-субъединице расположен гибкий клапан, который контактирует с консервативной областью 4 а70 и вызывает в ней конформационные изменения, необходимые для взаимодействия с (-35)-элементом промотора.
Р'-субъединица опосредованно участвует в узнавании промотора и образовании открытого промоторного комплекса. Так, в работе [8] показано, что область Р' с 260 по 309 аминокислоту, находящаяся в кольцевой конформации, участвует в связывании а70-субъединицы in vivo и in vitro, индуцируя в ней конформационные изменения,
позволяющие узнавать (-10)-элемент нематричной цепи ДНК. В работе Бродолина и соавт. [9] с помощью метода поперечных сшивок показано, что N-концевой домен ß' вместе с а70-субъедини-цей образует контакты с нематричной ДНК промотора lacUV5 в открытом комплексе.
Ранее считалось, что основная функция а-субъединицы - структурообразующая в процессе сборки фермента. В более поздних работах показаны не менее важные функции этой субъединицы в узнавании промотора и инициации транскрипции. Обнаружено [10], что изолированная а-субъ-единица образует стабильный специфический комплекс с UP-элементом (UP - верхний промо-торный элемент, расположенный выше (-35)-уча-стка промотора) ace оперона E. coli. Рекомбинант-ная РНК-полимераза, содержащая а-субъединицу с урезанным С-концевым доменом, не может направлять разделение нитей ДНК на gal P1 промоторе [11]. И хотя контактов С-концевого домена а-субъединицы с промоторами, лишенными UP-элементов, с помощью ДНКазного футпринтинга не обнаружено, авторы ряда работ [12, 13] полагают, что С-концевой домен а-субъединицы инициирует изомеризацию закрытого промоторного комплекса в открытый. В этих же работах показано, что а-субъединица через этот домен взаимодействует с активаторными белками.
Функция субъединицы а70 заключается в том, что она регулирует связывание РНК-полимеразы с промотором: эта субъединица сильно снижает сродство полного фермента к непромоторным последовательностям ДНК и увеличивает сродство к промоторным последовательностям [14]. Недавно показано, что а70 активно участвует в плавлении промотора [15]. При анализе аминокислотных последовательностей бактериальных а-субъединиц выявили четыре консервативных области [14], которые, в свою очередь, подразделяются на дополнительные сегменты. С помощью генетических исследований определены функции этих областей и сегментов. Области 2.4 и 2.1 а70 взаимодействуют с нематричной ДНК промотора lac UV5 в районе (-10)-элемента [16-18]. Специфические контакты области 2.3 с (-10)-элементом промотора стабилизируют открытый промоторный комплекс. Область 4.2 взаимодействует с (-35)-элементом, область 3.2 образует контакты внутри транскрипционного пузыря, а область 3.1 - в спейсерной области, между (-10)- и (-35)-элементами [19-21]. C помощью метода целенаправленного введения дисульфидных связей, ограничивающих локальную конформационную гибкость белка, также показано, что область 2 (2.1, 2.2 и 2.3) а70 способствует образованию открытого промоторного комплекса и инициации транскрипции [22]. Результаты рентгеноструктурного анализа бактериальной РНК-полимеразы T. aquaticus показали, что консервативные основные аминокислотные остатки субъединицы а70 образуют самые суще-
ственные контакты с фосфатным остовом ДНК и играют важную роль, направляя одноцепочеч-ный участок промоторной ДНК в активный участок РНК-полимеразы [23]. Из литературных данных следует, что а70 - динамический белок, подвергающийся конформационным изменениям при образовании полного фермента и в процессе инициации транскрипции.
РНК-полимеразы эукариот - это мультисубъ-единичные белки. Каталитическая функция всех трех РНК-полимераз эукариот обеспечивается общей структурой, включающей две больших субъединицы и десять маленьких [24]. Для того, чтобы работать в физиологически различающихся условиях, РНК-полимеразы должны участвовать в регуляторных процессах, которые определяют время и место начала и конца процесса транскрипции. У эукариот в осуществлении этого процесса, кроме РНК-полимераз, матрицы и субстратов, участвуют многочисленные транскрипционные факторы: базальные, ген-специфические, тканеспецифические, а также другие регуля-торные молекулы [25].
В последние годы успешно решается задача по изучению структуры и функциональных свойств РНК-полимераз эукариот и сопоставлению структурно-функциональных свойств РНК-полимераз про- и эукариот. С помощью методов ДНК-блот-тинга, образования поперечных сшивок и инактивации антителами показано, что самая большая субъединица (RPB1) РНК-полимеразы II эукариот является гомологом ß'-субъединицы РНК-полимеразы E. coli и участвует в связывании ДНК-матрицы [26]. Вторая по величине субъединица (RPB2) - гомолог ß-субъединицы и содержит участок связывания субстратов и ДНК [27, 28].
При сравнении аминокислотной последовательности RPB2 Drosophyla melanogaster и ß-субъ-единицы E. coli [29] выявилось 9 областей сильной гомологии. RPB3 имеет ограниченное сходство по аминокислотной последовательности с а-субъединицей. Функция а-субъединицы РНК-полимеразы E. coli, возможно, распределена между основными факторами транскрипции, в первую очередь TFIIF и ТВР (ТАТА-связывающий белок). ТВР, как и а-субъединица, осуществляет первичное опознавание и взаимодействие с промотором, а TFIIF снижает сродство РНК-полимеразы II к свободной ДНК, содержащей как про-моторные, так и непромоторные участки, регулируя ее взаимодействие с промоторсодержащей ДНК [24]. Сведения о функциях остальных субъединиц РНК-полимераз эукариот достаточно фрагментарны. Поэтому исследование структуры и функциональных свойств РНК-полимераз, транскрипционных комплексов прокариот и эукариот, выявление их гомологии, является актуальной задачей, решение которой будет способствовать пониманию молекулярных механизмов
функционирования ядерных РНК-полимераз эукариот.
Исходя из того, что ранее нами [30] и другими авторами [31] показано взаимодействие РНК-полимеразы: II с TBP, и основываясь на структурной и функциональной гомологии больших субъединиц РНК-полимераз прокариот и эукариот, мы предположили, что РНК-полимераза E. coli также может взаимодействовать с эукариотическим ТВР. Первые же опыты подтвердили это предположение. В данной работе представлены результаты изучения взаимодействия полной РНК-полимеразы E. coli, ее минимального фермента и а-еубъ-единицы с базальным фактором транскрипции эукариот ТВР. В работе использовали субъединицу а70, присоединение которой к минимальному ферменту приводит к образованию полного фермент
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.