научная статья по теме ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА ОКТАРФИНА С МЕМБРАНАМИ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ КРЫСЫ Химия

Текст научной статьи на тему «ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА ОКТАРФИНА С МЕМБРАНАМИ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ КРЫСЫ»

УДК 577.112.6+577.171.6:611.453

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА ОКТАРФИНА С МЕМБРАНАМИ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ КРЫСЫ

© 2012 г. Ю.Н. Некрасова1, Ю.А. Золотарев2, Е.В. Наволоцкая1*

1 Филиал института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290 Пущино Московской обл., просп. Науки, 6; факс: (4967)33-0527, электронная почта: navolotskaya@fibkh.serpukhov.su, elenanavolots@gmail.com 2 Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Академика Курчатова, 2; факс: (495)196-0221

Поступила в редакцию 17.05.12 После доработки 01.06.12

Получен меченный тритием селективный агонист неопиоидного рецептора Р-эндорфина синтетический пептид октарфин (ТРЕУТЬРК, фрагмент 12—19 Р-эндорфина), удельная активность 28 Ки/ммоль. Изучено связывание [3Н]октарфина с мембранами коры надпочечников крысы в нормальных условиях, а также после холодового и теплового шока. Установлено, что в норме [3Н]октарфин с высоким сродством и специфичностью связывается с неопиоидным рецептором Р-эндорфина на мембранах коры: Кй1 = 36,3 ± 2,5 нМ, ВШах = 41,0 ± 3,8 пмоль/мг белка. Специфическое связывание [3Н]октарфина с мембранами ингибировал немеченый Р-эндорфин (К = 33,9 ± 3,6 нМ) и агонист неопиоидного рецептора декапептид иммунорфин (К = 36,8 ± 3,3 нМ); немеченые налоксон, [Ьеи5]энкефалин, [Ме^энкефалин, а-эндорфин, у-эндорфин и кортикотропин были не активны (К > 1мкМ). Холодовой и тепловой шок приводили к снижению аффинности связывания: Кй2 = 55,6 ± 4,2 нМ и Кй3 = 122,7 ± 5,6 нМ соответственно. В обоих случаях плотность рецепторов практически не изменялась. Таким образом, даже кратковременный температурный шок вызывает значительное изменение активности неопиоидного рецептора Р-эндорфина мембран коры надпочечников.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Р-эндорфин, налоксон, пептиды, рецепторы, кора надпочечников.

Известно, что Р-эндорфин связывается не только с опиоидными (^ и 8) [1], но и с неопио-идными (нечувствительными к опиоидному антагонисту налоксону) рецепторами, которые были впервые описаны Хейзум и соавт. на трансформированных лимфоцитах человека [2]. Затем неопиоидные рецепторы Р-эндорфина были обнаружены на Т-лимфоцитах крови человека [3, 4], спленоцитах [5] и перитонеальных макрофагах [6] мыши, на синаптических мембранах головного мозга [7] и в коре надпочечников [8] крысы, а также на клетках ряда лейкеми-ческих линий: мышиной тимомы БЬ-4 [9, 10], человеческой моноцитподобной линии и937 [11] и Т-лимфобластной линии 1игка1 [12].

Несколько лет назад мы локализовали участок молекулы Р-эндорфина, ответственный за связывание с неопиоидным рецептором — фрагмент 12—19 (ТРЕУТЬРК), и синтезировали пеп-

* Адресат для корреспонденции.

тид (авторское название — октарфин), соответствующий этой последовательности [13, 14]. Эксперименты показали, что октарфин является селективным агонистом неопиоидного рецептора Р-эндорфина [15] и обладает иммуностимулирующей [16] и кардиопротекторной [17, 18] активностью.

Цель настоящей работы — изучение связывания [3Н]октарфина с мембранами коры надпочечников крысы в норме, а также после холодового и теплового шока.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали a-, ß-, у-эндорфины, [Leu5] - и [Ме1:5]энкефалины, кортикотропин, налоксон, кортикостерон («ICN Biomedicals», США), фенилметилсульфонилфторид (PMSF) и Tris («Flu-ka», США), сцинтиллятор Ready Gel («Beckman», США), все остальные реагенты и растворители

1693

были отечественного производства и их использовали после соответствующей очистки.

Крыс линии Wistar весом 180—200 г получали из питомника Филиала Института биоорганической химии РАН.

Октарфин (TPLVTLFK) и иммунорфин (SL-TCLVKGFY) были синтезированы на автоматическом синтезаторе Vega Coupler, модель C250 (США) и очищены с помощью препаративной обращенно-фазовой хроматографии (хроматограф «Gilson», Франция, колонка Waters Sym-metryPrep C18, 19 х 300 мм, «Malva», Греция) как описано ранее [19]. По завершении сборки защищенной пептидной цепи конечный продукт деблокировали с одновременным отщеплением его от полимера с помощью безводного фтористого водорода в присутствии скавенджеров. Синтезированные пептиды были охарактеризованы данными аналитической обращенно-фа-зовой ВЭЖХ (хроматограф «Gilson», Франция, колонка XTerra RP18, «Malva», Греция), аминокислотного анализа (гидролиз 6 М HCl, 24 ч, 110°; аминокислотный анализатор LKB 4151 Alpha Plus (Швеция) и масс-спектрального анализа (масс-спектрометр «Finnigan», США).

[3Н]Октарфин получали с помощью реакции высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО) [20]. К раствору 2,0 мг октарфина в 0,5 мл воды добавляли 50 мг окиси алюминия и упаривали на роторном испарителе. Окись алюминия с нанесенным пептидом смешивали с 10 мг катализатора (5%-ный Rh/Al2O3). Полученную твердую смесь помещали в ампулу объемом 10 мл. Ампулу ва-куумировали, заполняли газообразным тритием до давления 250 мм рт. ст., нагревали до 170° и выдерживали при этой температуре 20 мин. Затем ампулу охлаждали, вакуумировали, продували водородом и повторно вакуумировали. Меченый пептид экстрагировали из твердой реакционной смеси двумя порциями по 3 мл 50%-ного водного этанола, полученный раствор объединяли и упаривали. Для удаления лабильного трития процедуру повторяли дважды. Очистку [3Н]октарфина проводили методом ВЭЖХ со спектрофотометром «Beckman» при длинах волн 254 и 280 нм на колонке «Kromasil», 4 х 150 мм, зернение 5 мкм при 20°, элюент — 0,1%-ная трифторуксусная кислота, градиент метанола 42—70% за 20 мин, скорость потока 3 мл/мин. Включение трития в пептид рассчитывали с использованием жидкостного сцинтилляционно-го счета.

Мембраны из коры надпочечников крыс выделяли по методике [21]. Концентрацию белка определяли с помощью метода Лоури, используя в качестве стандарта БСА [22].

Реакцию связывания [3Н]октарфина с мембранами проводили в 50 мМ Tris-HCl-буферном растворе, pH 7,5, по следующей схеме: в стеклянные силиконизированные пробирки вносили 100 мкл меченого пептида (10-10—10-7 М, три параллельные пробы для каждой концентрации), 100 мкл буфера (общее связывание) или 10—3 М раствора немеченого пептида в буфере (неспецифическое связывание) и 800 мкл свежеприготовленной суспензии мембран (0,2 мг белка). Пробирки инкубировали при 4° в течение 1 ч. По окончании инкубации реакционную смесь фильтровали через стекловолокнистые фильтры GF/C («Whatman», Англия). Фильтры трижды промывали 5 мл ледяного буферного раствора. Радиоактивность на фильтрах подсчитывали с помощью жидкостного сцинтилляцион-ного счетчика LS 5801 («Beckman», США). Величину специфического связывания [3Н]октар-фина с мембранами определяли по разности между его общим и неспецифическим связыванием и выражали в молях на 1 мг белка. Для определения параметров специфического связывания меченого октарфина с мембранами (равновесной константы диссоциации Kd и Bmax — максимальной связывающей способности в расчете на 1 мг белка) строили графики зависимости отношения молярных концентраций связанного (B) и свободного (F) меченого октарфина от молярной концентрации связанного меченого пептида (B) [23].

Для изучения способности налоксона и немеченых пептидов ингибировать специфическое связывание [3Н]октарфина с мембранами, свежевыделенные мембраны (0,2 мг белка) инкубировали с меченым октарфином (20 нМ) и одним из потенциальных конкурентов (диапазон концентраций 10-12—10-5 М, три повтора для каждой концентрации) как описано выше. Константу ингибирования (K) определяли по формуле K = [IC]50/(1 + [L]/Kd), где [L] - молярная концентрация [3Н]октарфина; Kd — равновесная константа диссоциации комплекса [3Н] октарфин — рецептор; [IC]50 — концентрация немеченого лиганда, вызывающая 50%-ное ингибирование специфического связывания меченого октарфина [24]. Величину [IC]50 определяли графически на основании кривой инги-бирования (график зависимости % ингибирова-ния от молярной концентрации ингибитора). Значение Kd определяли предварительно как описано выше.

Для создания модели холодового шока крыс выдерживали в течение 3 мин в состоянии свободного плавания в кювете с водой при 4°. Для создания модели теплового шока крыс помещали в вентилируемую термокамеру при 40° на 1 ч.

СВЯЗЫВАНИЕ ОКТАРФИНА С МЕМБРАНАМИ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ

1695

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основные характеристики октарфина и им-мунорфина (% чистоты, данные аминокислотного анализа, молекулярная масса) приведены в табл.1.

С помощью реакции ВТКИО после очистки был получен [3Н] октарфин с удельной активностью 28 Ки/ммоль. Время удерживания [3Н]октарфина и немеченого октарфина на колонке Кгота811 С18 (условия хроматографии приведены в разделе «Материалы и методы») совпадало и составляло 15 мин; отношение экс-тинкций при 254 и 280 нм для меченого и немеченого пептида также совпадало, что свидетельствует о сохранении химического строения ок-тарфина при замещении водорода на тритий.

Связывание [3Н]окгарфина с мембранами коры надпочечников крысы. Эксперименты показали, что в выбранных нами условиях (раздел «Методы исследования») [3Н] октарфин специфически связывается с мембранами коры надпочечников крысы. На рис. 1 показана зависимость величины специфического связывания [3Н]октарфина с мембранами при 4° от времени инкубации. Видно, что динамическое равновесие в системе меченый пептид—рецептор устанавливалось примерно через 1 ч и сохранялось не менее 2 ч. Поэтому для определения величины равновесной константы диссоциации (К¿) реакцию связывания [3Н] октарфина с мембранами проводили в течение 1 ч. Неспецифическое связывание [3Н]октарфина в этих условиях составляло 12,3 ± 2,4% от величины его общего связывания.

На рис. 2 приведен график Скэтчарда, характеризующий специфическое связывание [3Н]ок-тарфина с мембранами коры надпочечников крысы в норме (график 1). Линейность графика свидетельствует о наличии в коре надпочечников одного типа рецепторов к пептиду, а величина Ка1 = 36,3 ± 2,5 нМ — о высоком сродстве пептида к рецептору. Плотность рецепторов — Втах — составила 41,0 ± 3,8 пмоль/мг белка. Графики 2 и 3 показывают, что как холо

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком