БИОХИМИЯ, 2009, том 74, вып. 9, с. 1252 - 1259
УДК 577.352.2
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТЕТРАЗАМЕЩЕННОГО КАТИОННОГО ФТАЛОЦИАНИНА АЛЮМИНИЯ С ИСКУССТВЕННЫМИ И ПРИРОДНЫМИ МЕМБРАНАМИ
© 2009 г. A.A. Пашковская1, И.В. Перевощикова1, В.Е. Майзлиш2, Г.П. Шапошников2, E.A. Котова1, Ю.Н. Антоненко1*
1 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; факс: (495)939-3181, электронная почта: antonen@genebee.msu.ru
2 Ивановский государственный химико-технологический университет, 153000 Иваново, просп. Ф. Энгельса, 7
Поступила в редакцию 18.07.08 После доработки 23.10.08
При изучении свойств водорастворимого тетразамещенного катионного фталоцианина алюминия (AlPcN4) обнаружено более сильное связывание этого фотосенсибилизатора с липидными мембранами по сравнению с тетрасульфированными фталоцианинами алюминия и цинка, что проявилось также в повышенной фотодинамической активности AlPcN4, измеренной по фотосенсибилизированному повреждению грами-цидиновых каналов в плоской бислойной липидной мембране. Наибольшие различия в фотодинамической активности катионных и анионных фотосенсибилизаторов наблюдались на мембране, содержавшей отрицательно заряженные липиды, что свидетельствует о существенном вкладе электростатического взаимодействия в процесс связывания с мембраной. Данные об ингибировании фторид-анионами фотодинамической активности и связывания с липидной мембраной как тетраанионного, так и тетракатионного фталоциани-нов алюминия подтверждают высказанную нами гипотезу о том, что взаимодействие заряженных метал-лофталоцианинов с фосфолипидной мембраной определяется в значительной степени координационным взаимодействием центрального атома металла с фосфатной группой липида.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: плоская бислойная липидная мембрана, фотосенсибилизатор, фталоцианин, син-глетный кислород, ионные каналы, грамицидин А, липосомы, митохондрии.
Благодаря своим уникальным свойствам фталоцианины находят широкое применение при создании новых материалов, в частности, как стойкие красители, катализаторы, строительные блоки для наноструктур, активные компоненты оптических химических сенсоров, полупроводниковых и электрохромных устройств, запоминающих систем, жидкокристаллических цветных дисплеев, фотоэлектрических преобразователей солнечной энергии [1—5]. В последние 20 лет фталоцианины также используются как фотосенсибилизаторы в фотодинамической
Принятые сокращения: БЛМ — бислойная липидная мембрана, А1РсМ4 — тетратрибутиламмониевая соль тетра-4-хлорметилфталоцианина гидроксиалюминия, А1Ре84 — четыреждысульфированный фталоцианин алюминия, /пРс84 — четыреждысульфированный фталоцианин цинка, БРИРС — дифитаноилфосфатидилхолин, БРИРв — дифитаноилфосфатидилглицерин, ДМФА — М,М-диметилформамид.
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
терапии рака [6]. Эффективны в данной области фталоцианины алюминия, цинка и кремния, обладающие высоким квантовым выходом генерации синглетного кислорода [7]. Для медицинского применения важным свойством фтало-цианинов является водорастворимость ряда их производных, которая достигается присоединением анионных или катионных заместителей. Положительно заряженные производные фта-лоцианинов [8] оказались эффективными агентами для фотодинамической инактивации бактерий [9—14], отрицательно заряженная оболочка которых препятствует проникновению анионных фотосенсибилизаторов. Согласно результатам многих исследований мембраны — одна из основных мишеней фотодинамического воздействия [15, 16], поэтому актуально выяснение механизма взаимодействия фталоцианинов с мембранами. Известно, что важную роль в процессе связывания с липидными мембранами порфиринов и подобных им соединений играет
гидрофобное взаимодействие [17, 18]. Показанное в ряде работ ингибирующее влияние фторида на фотодинамическое действие и связывание с мембранами сульфированных фталоцианинов алюминия [19—22] было объяснено в предположении определяющей роли гидрофобных взаимодействий уменьшением связывания с мембраной вследствие увеличения отрицательного заряда молекулы фталоцианина при образовании комплекса с фторид-анионом [23]. Однако в дальнейшем нами были получены данные, свидетельствующие о том, что связывание с фосфолипидной мембраной сульфированных фталоцианинов алюминия и цинка определяется в значительной степени координационным взаимодействием центрального атома металла с фосфатной группой липида [24].
Цель настоящей работы — исследование фо-тосенсибилизирующей активности и связывания с мембраной нового катионного фталоциа-нина алюминия.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Тетратрибутиламмониевую соль тетра-4-хлор-метилфталоцианина гидроксиалюминия (AlPcN4) получали при взаимодействии последнего с три-бутиламином по следующей схеме:
HOAlPc(4-CH2Cl)4 + N(C4H9)3 ^ HOAlPc(4-CH2-
N+(C4H9)3Cl-)4.
150 мг (0,20 ммоль) AlPcN4 растворяли в б мл ДМФА, добавляли 24,2 мл 5%-ного спиртового раствора трибутиламина. Реакционную массу нагревали до кипения и выдерживали в течение 7 ч. После охлаждения реакционную массу выливали в 50 мл воды и отфильтровывали. Фильтрат упаривали под вакуумом. Продукт промывали диметиловым эфиром, сушили. Выход — 190 мг (б3%). Найдено, %: С б8,53; H 9,27; N 10,99; Cl 8,71. C84N12H129Cl4AlO. Вычислено, %: С б7,б3; H 8,72; N 11,27; Cl 9,51.
В работе использовали четыреждысульфиро-ванные фталоцианины алюминия (AlPcS4) и цинка (ZnPcS4) фирмы «Porphyrin Products» (США), грамицидин А фирмы «Sigma» (США), липиды фирмы «Avanti Polar Lipids» (США). Плоскую бислойную мембрану формировали из 2%-ного раствора липида в декане по методике Мюллера [25] на отверстии диаметром 0,55 мм в тефлоновой перегородке, которая разделяла две водные фазы, содержащие 100 мМ KCl, 10 мМ Mes, 10 мМ Tris, 10 мМ ß-аланин, pH 7. Растворы пептидов в большинстве случаев добавляли с цис-стороны мембраны в различных концентра-
циях. цис-Стороной условно называем сторону ячейки, к которой прикладывается положительный потенциал и с которой освещается мембрана. Электрический ток через мембрану измерялся с помощью усилителя Keithley 428 (США). Аналоговый сигнал передавался в компьютер с помощью платы LabPC 1200 («National Instruments, Inc.», США) и анализировался с помощью программы WinWCP Strathclyde Electrophysiology Software, разработанной Дж. Демпстером (University of Strathclyde, Великобритания). Для регистрации проводимости мембраны применялись электроды, изготовленные из хлорированной серебряной фольги, которые погружались непосредственно в ячейку. Для освещения мембраны постоянным светом использовалась лампа накаливания мощностью излучения вблизи мембраны 400 мВт/см2. Вспышка света осуществлялась ксеноновой лампой-вспышкой с энергией 0,3 Дж и длительностью вспышки < 3 мс.
Электрофоретическую подвижность липосом измеряли на приборе Zetasizer Nano («Malvern», Великобритания) способом, описанным в работе [22]. Моноламеллярные липосомы из яичного фосфатидилхолина или общего липида Escherichia coli готовили в растворе 10 мМ KCl, 5 мМ Mes и 5 мМ Tris, рН 7. Полученную муль-тиламеллярную смесь пропускали через поликарбонатный фильтр («Nucleopore») с отверстиями диаметром 0,1 мкм с помощью экструдера («Avanti Polar Lipids, Inc.», США).
Спектры флуоресценции красителей регистрировали на спектрофлуориметре «Панорама флюорат-02» фирмы «Люмекс» (Москва). Для определения квантового выхода генерации синглетного кислорода фталоцианинами измеряли кинетику светозависимого падения флуоресценции 9,10-диметилантрацена (длина волны возбуждения 375 нм, длина волны регистрации 42б нм) под действием света с длиной волны б80 нм в присутствии металлофталоциани-нов согласно [2б—28]. Квантовый выход для ZnPcS4 в DMSO принимали равным 0,б8 согласно [29].
Митохондрии печени крысы выделяли методом дифференциального центрифугирования по стандартной методике. Среда выделения (pH 7,4) содержала 300 мМ сахарозы, 10 мМ Mops, 1 мM ЭДTA. Измерения проводились в буферном растворе (pH 7,5), содержавшем 10 мМ KCl, 70 мМ сахарозы, 190 мМ маннита, 20 мМ Hepes, 5 мМ сукцината, 0,5 мМ ЭДТА. Концентрация митохондрий в кювете составляла ~0,2 мг/мл.
Для возбуждения флуоресценции использовался гелий-неоновый лазер б33 нм на эпи-флуоресцентном инвертированном микроскопе Olympus IMT-2 (США) с водно-иммерсионным
объективом 40х, NA («Carl Zeiss Jena», Германия). Флуоресцентный сигнал проходил через соответствующий дихроичный разделитель и проецировался на 50-мкм сердцевину световода, связанного с лавинным фотодиодом SPCM-AQR-13-FC («PerkinElmer Optoelectronics, Vaud-reuil», Канада). Сигнал преобразовывался с помощью интерфейсной карты Flex02-01D/C («Correlator. com», США). Данные фиксировались в течение 30 с. Записывалась флуоресценция от конфокального объема, расположенного в 50 мкм над тонким стеклом, на которое наносилось 60 мкл суспензии митохондрий в буфере.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее для оценки эффективности фотосенсибилизаторов в нашей лаборатории был разработан метод регистрации фотоповреждения ка-налообразующего пептида грамицидина А, основанный на измерении уменьшения индуцированного грамицидином тока через модельную бислойную липидную мембрану (БЛМ) в ответ на воздействие видимым светом в присутствии фотосенсибилизатора [22, 30, 31]. В настоящей работе с помощью этого метода проведено сравнение фотосенсибилизирующей активности
[Фотосенсибилизатор], М
Рис. 1. Зависимости амплитуды фотоинактивации грамицидина А от концентраций AlPcN4 (1), ZnPcS4 (2), AlPcS4 (3) на мембране из DPhPC (a) и на мембране из смеси DPhPC/DPhPG 70/30% (б). Буферный раствор (pH 7) содержал 100 мМ KCl, 10 мМ Mes, 10 мМ Tris
а
Z, мВ
Рис. 2. Зависимости Ç-потенциалов липосом из липидов E. coli (а) и яичного фосфатидилхолина (б) от концентрации AlPcN4 (1), ZnPcS4 (2), AlPcS4(3). Буферный раствор содержал 10 мМ KCl, 5 мМ Mes, 5 мМ Tris, рН 7
Время, мин
Рис. 3. Кинетика уменьшения флуоресценции 9,10-диме-тилантрацена (Г) в растворе БМ80 (длина волны возбуждения 375 нм, длина волны регистрации 426 нм) под действием света с длиной волны 680 нм в присутствии Л1РеК4 (1), 2пРе84 (2), Л1Ре
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.