БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып.. 11, с. 1583 - 1595
УДК 577.083.03
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСА ШАРКИ СЛИВЫ С АНТИТЕЛАМИ, КОНЪЮГИРОВАННЫМИ С КОЛЛОИДНЫМ ЗОЛОТОМ, И РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВИРУСА
© 2010 г. Н.А. Бызова1*, И.В. Сафенкова1, С.Н. Чирков2, В.Г. Авдиенко3, А.Н. Гусева3, И.В. Митрофанова4, А.В. Жердев1, Б.Б. Дзантиев1, И.Г. Атабеков2
1 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33; факс: (495)954-2804, электронная почта: nbyzova@inbi.ras.ru 2 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова,
119991 Москва 3 Центральный НИИ туберкулеза РАМН, 107564 Москва, Яузская аллея, 2
4 Никитский ботанический сад — ННЦНациональной академии аграрных наук Украины, 98648 Ялта, АР Крым, Украина
Поступила в редакцию 23.06.10 После доработки 16.07.10
Получены два препарата моноклональных антител (АТ) против вируса шарки сливы (ВШС), распознающие штаммы Б, М и С ВШС. Синтезированы конъюгаты этих АТ с наночастицами коллоидного золота (КЗ) среднего диаметра 26 нм. На приборе В1аеоге Х определены константы связывания нативных и конъюгиро-ванных с КЗ антител с ВШС. Методами просвечивающей электронной микроскопии и атомно-силовой микроскопии охарактеризованы комплексы, образуемые конъюгатами антитело—коллоидное золото с вирионами ВШС. С использованием конъюгатов АТ-КЗ оптимального состава разработан иммунохрома-тографический метод детекции ВШС, характеризующейся пределом обнаружения 3 нг/мл и длительностью 10 мин. Проведена апробация метода при определении ВШС в образцах листьев косточковых плодовых культур. Показано соответствие результатов, получаемых с помощью иммунохроматографической тест-системы и «сэндвич»-варианта иммуноферментного анализа. Разработанная тест-система может быть использована в полевых условиях и найти применение при мониторинге вирусной инфекции и в карантинных целях.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: вирус шарки сливы, моноклональные антитела, коллоидное золото, просвечивающая электронная микроскопия, атомно-силовая микроскопия, иммунохроматографический анализ.
Вирус шарки (оспы) сливы (род Potyvirus, сем. Ро1уушёае) — самый вредоносный патоген косточковых плодовых культур. Вирионы ВШС представляют собой нитевидные частицы длиной 750 нм и диаметром 15 нм, которые состоят из одной молекулы геномной РНК положитель-
Принятые сокращения: АСМ — атомно-силовая микроскопия; АТ — антитела; АТ1 — клон 1D5B1 моноклональных антител; АТ2 — клон 2H2F6 моноклональных антител; ВШС — вирус шарки сливы; ИФА — иммунофермент-ный анализ; ИХА — иммунохроматографический анализ; КЗ — коллоидное золото; ПЭМ — просвечивающая электронная микроскопия; ФБС — 50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,4, с 0,1 М NaCl; ФБСТ - ФБС с 0,05% Tween 20; ФБСТБ - ФБС с 0,05% Tween 20 и 0,05% БСА; IgG - иммуноглобулины класса G. * Адресат для корреспонденции.
ной полярности и белка оболочки с молекулярной массой 36—38 кДа [1]. Известно шесть штаммов ВШС — Dideron (D), Marcus (M), Cherry (C), El Amar (EA), Winona (W) и Rec (ре-комбинантный между D и M), — различающихся по нуклеотидной последовательности, антигенной специфичности, патогенности и эпидемиологическим свойствам [2].
У культурных и дикорастущих растений представителей рода Prunus (слива, абрикос, персик и др.) ВШС вызывает заболевание, называемое шаркой, которое приводит к значительным потерям урожая из-за преждевременного опадания и ухудшения качества плодов. За последние 30 лет экономический ущерб от данного заболевания по всему миру оценивается в десятки миллиардов евро, а количество выруб-
1583
ленных деревьев исчисляется миллионами [3]. Хотя ВШС в большинстве стран является карантинным объектом, он широко распространен в насаждениях косточковых культур, практически по всему миру [4]. Обычно вирус проникает в новый регион в результате интродукции зараженных растений и распространяется там при вегетативном размножении посадочного материала, а также разными видами переносчиков. Единственный способ борьбы с шаркой сливы — своевременное выявление и ликвидация источников инфекции, в связи с чем первостепенное внимание уделяется совершенствованию методов диагностики.
Для детекции ВШС разработаны чувствительные серологические и молекулярные методы лабораторной диагностики [5, 6], применение которых в соответствии с диагностическим протоколом [7], одобренным Европейской организацией по защите растений (European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO)), обеспечивает надежное выявление этого вируса. Решающее влияние на эффективность обнаружения ВШС в насаждениях косточковых плодовых культур оказывает точность отбора образцов для лабораторного анализа. Поскольку типичные симптомы вирусной инфекции наблюдаются далеко не всегда, визуальная оценка зараженности недостаточно надежна для отбора. Точность отбора образцов может быть значительно повышена быстрой предварительной оценкой зараженности растений в полевых условиях с помощью методов внелабора-торной диагностики. Один из таких методов — иммунохроматографический анализ (ИХА) на тест-полосках, по эффективности выявления зараженных вирусами растений не уступающий иммуноферментному анализу (ИФА) [8—12]. Иммунохроматографию отличает высокая скорость, чувствительность и простота выполнения; анализ не требует дополнительного оборудования и реагентов, а также специальной подготовки персонала. О надежности иммунохро-матографических тест-систем свидетельствует их включение в диагностические протоколы EPPO для определения ряда фитопатогенных вирусов [13, 14].
Недавно нами впервые в России была разработана технология производства тест-полосок для детекции вирусов растений, основанная на использовании кроличьих поликлональных антител к вирусам и наночастиц коллоидного золота (КЗ) [15, 16]. Тест-полоски за 10 мин надежно выявляли в зараженных растениях такие разные по морфологии вирусы, как вирусы Х и Y картофеля, вирус табачной мозаики, вирус мягкой мозаики фасоли и вирус крапчатости
гвоздики. Однако тест-полоски на основе по-ликлональных антител, изготовленные по этой технологии, оказались малоэффективными для диагностики ВШС в образцах косточковых плодовых культур.
Цель данной работы — получение и характеристика моноклональных антител против ВШС и разработка на их основе иммунохроматогра-фической тест-системы для экспрессной детекции этого вируса в образцах листьев косточковых культур.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Реактивы. В работе использовали козьи (GAMIss), кроличьи (RAMIss), овечьи (SAMIss) антитела против IgG мыши и овечьи (SARIss) антитела против IgG кролика производства ООО «Имтек» (Россия), антитела против IgG мыши (козьи («Arista Biologicals», США) и кроличьи («DakoCytomation», Дания)), конъюгат антител крупного рогатого скота против IgG мыши c пероксидазой (ООО «Медгамал», Россия), Triton Х-100, Tween 20, дигидрохлорид 3,3',5,5'-тетраметилбензидина, азид натрия, по-ливинилпирролидон (М ~29 кДа), Hepes («Sigma», США), золотохлористоводородную кислоту («Fluka», Германия), БСА, цитрат натрия, неполный адъювант Фрейнда, глицин («MP Biomedicals», Великобритания), глицерин («ДиаэМ», Россия), поливинилформаль, фосфорно-вольф-рамовую кислоту («SPI Supplies», США), детергент P20 («Biacore AB», Швеция). Все соли, кислоты, щелочи и органические растворители были аналитической или химической чистоты.
При получении моноклональных антител использовали среду RPMI-1640, сыворотку плода коровы, HAT-среду HybriMax, НТ-среду, меркаптоэтанол, пируват натрия, пенициллин, стрептомицин, пристан, белок А-сефарозу CL-4B («Sigma»). Для проведения ИФА использовали 96-луночные прозрачные полистироловые микропланшеты Costar 9018 («Corning Costar», США). Растворы для получения КЗ и его кон-ъюгатов готовили на воде, деионизированной на установке MilliQ («Millipore», США).
Получение ВШС. Изолят вируса (PPV-NAT, штамм D) был любезно предоставлен Э. Майс-сом (Institute of Plant Diseases and Plant Protection, University of Hannover, Германия) [17]. Вирус размножали в растениях табака Nicotiana benthamiana и выделяли в препаративных количествах по описанной методике [18].
Получение моноклональных антител. Гибри-домы-продуценты антител против ВШС получали путем слияния миеломных клеток синген-
ной линии Sp2.0 мышей BALB/c и иммунных спленоцитов BALB/c с помощью полиэтиленгли-коля [19]. Схема иммунизации включала в себя три внутрибрюшинные инъекции ВШС (50 мкг на одно животное, с двухнедельными интервалами) в смеси (1 : 1) с неполным адъювантом Фрейнда. Титр антител против ВШС в сыворотке крови определяли методом ИФА. Для получения иммунных спленоцитов использовали мышей с максимальным титром.
Гибридные клетки культивировали при 37° в атмосфере с 5% СО2 в СО2-инкубаторе («Queue», США) в селективной НАТ-среде, приготовленной на основе коммерческой среды RPMI-1640, к которой добавляли инактивированную сыворотку плода коровы (20%), меркаптоэтанол (5 мкМ), пируват натрия (1 мМ), пенициллин (10 ед/мл), стрептомицин (10 ед/мл) и HAT-кон-центрат HybriMax (1 : 50). Эту среду через неделю частично заменяли свежей средой, через две недели меняли на НТ-среду (НАТ-среда без ами-ноптерина), а через месяц — на среду, содержащую все компоненты, кроме HAT-концентрата.
Начиная с 10-х суток после слияния клеток, супернатанты лунок с визуализированным ростом проверяли методом непрямого твердофазного ИФА на наличие гибридом, продуцирующих антитела против ВШС. Отобранные моноклоны наращивали в 50-мл флаконах in vitro и в виде асцитных опухолей в перитонеальной полости мышей BALB/c, получивших за неделю до введения моноклонов внутрибрюшинную инъекцию 1 мл пристана [20]. Гибридомы вводили в 0,5-1 мл среды RPMI-1640 ((1-4) ■ 106 клеток на одно животное). Через 10-20 сут после развития асцита выделяли асцитную жидкость. Для очистки антител использовали аффинную хроматографию на белок А-сефарозе GL-4B [21].
Определение титров антител с помощью непрямого твердофазного ИФА. ВШС сорбировали в лунках микропланшета в течение ночи при 4° из 100 мкл раствора с концентрацией вируса 0,2 мкг/мл в 50 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,4, с 0,1 М NaCl (ФБС). Ми
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.