УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2008, том 128, № 6, с. 553-561
УДК 591 .557.6:5743:579.8(048.8):574.3:576.893.1:57.012 .4
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИЙ BURKHOLDERIA CENOCEPACIA С ПОЧВЕННЫМИ ИНФУЗОРИЯМИ TETRAHYMENA PYRIFORMIS В ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ БИОПЛЕНОК
© 2008 г. В. И. Пушкарева, А. А. Каминская, М. М. Мойсенович, В. Ю. Литвин, Н. В. Алексеева, Т. В. Степанова, Ю. М. Романова, С. А. Ермолаева
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
На популяционном и структурном уровнях с помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии (КСЛМ) экспериментально показано взаимодействие патогенных для человека и растений Burkholderia cenocepacia и простейших Tetrahymena pyriformis - сочленов почвенных и водных биоценозов. Установлено, что в планктонной фазе сосуществования между популяциями устанавливаются симбиотические отношения по типу "паразит-хозяин". В процессе формирования биопленок выявлена значительная роль инфузорий в ассоциациях, как с родительским штаммом, так и с мутантом bcb++. Сделан вывод, что по мере созревания биопленок усиливается цитопатогенное воздействие бактерий на клетки простейших с блокированием фагоцитоза и их тотальной гибелью. Установлено, что биопленки обеспечивают устойчивое существование возбудителей сапронозов в почвах и водоемах.
Давно известно, что основной контроль численности бактерий в почвах и водоемах осуществляют хищные простейшие - наиболее массовые представители почвенных и водных экосистем. Однако при поглощении некоторых микроорганизмов амебами или инфузориями речь идет не о простом "выедании", а об их возможности становиться эндосимбионтами одноклеточных эукари-отов и даже паразитами [1, 11, 18].
Целенаправленное изучение взаимодействий свободноживущих амеб и инфузорий с патогенными бактериями начали в конце XX столетия американские исследователи в связи с открытием грамотрицательных бактерий Legionella pneumophila, вызывающих вспышки тяжелых нетипичных пневмоний, часто с летальным исходом. Оказалось, что природной средой обитания легионелл служат пресноводные водоемы, а микроорганизмы обладают высокой экологической пластичностью, часто выделяясь из ассоциаций с микроводорослями и простейшими - амебами и инфузориями [28, 29].
Закономерности взаимодействия свободноживущих простейших и легионелл в эксперименте, а также факты изоляции бактерий от амеб, взятых из воды и ила [43, 44], заставили признать одноклеточных простейших резервуарными хозяевами легионелл в природе.
В последующие два десятилетия стремительно расширялся список не только признанных возбудителей инфекций, взаимодействующих с простейшими, но и потенциально патогенных микроорганизмов - "вчерашних сапрофитов", способ-
ных заселять "рукотворные" местообитания -объекты непосредственного окружения современного человека. Это - системы водоснабжения, тепличные хозяйства, предприятия хранения и переработки продуктов, медицинские стационары [5-9].
В плане взаимодействий с простейшими внимание исследователей привлекли микобактерии (пять видов), псевдомонады (пять видов) и бурк-холдерии, возбудители чумы, псевдотуберкулеза и другие иерсинии, холерные вибрионы, сальмонеллы, эшерихии, франциселлы (возбудитель туляремии), кампилобактеры, а из грамположитель-ных микроорганизмов - листерии, эризипелотрик-сы [12, 13]. Эти микроорганизмы различного таксономического статуса обладают выраженным конвергентным сходством - возможностью существования во внешней среде в качестве полноправных сочленов почвенных и водных биоценозов.
Микроорганизмы в природных экосистемах существуют не только в планктонном состоянии, но и в виде биопленок, образуя ассоциации с водорослями, высшими растениями (в ризосфере, внутри них), с простейшими, ракообразными и другими организмами [2, 4, 10, 17]. Биопленочные сообщества играют важную роль в продукции и разложении органической материи. По мнению Шапиро [46, 47], при совместном существовании бактериальных популяций повышается их устойчивость к меняющимся условиям окружающей среды. Благодаря высокой экологической пла-
стичности ассоциаций изменяется метаболизм, гидродинамика, межклеточные связи и др. [2, 49].
Первыми в отношении биопленок были изучены холерные вибрионы и легионеллы, которые, как известно, тесно связаны с гидробионтами, однако и представители других групп - кампилобак-теры, псевдомонады, клебсиеллы, сальмонеллы, стрептококки, листерии - также привлекли внимание исследователей [15, 20-24, 26, 30-36, 4852].
Экзополисахариды, белки, нуклеиновые кислоты и другие компоненты, составляющие мат-рикс биопленок, защищают бактерии от воздействия абиотических факторов среды.
Изучение процессов формирования биопленок позволяет выявить роль не только абиотических, но и биотических факторов в реализации данной стратегии существования микроорганизмов в природе, что особенно важно для возбудителей сапронозных инфекций, обитающих в почвах и водоемах [23-27, 38-42].
Бактерии комплекса Burkholderia cepacia (девять геномоваров), известные ранее как фитопа-тогены пасленовых, лилейных, злаковых и др., обитают в водоемах и почве, заселяя ризосферу растений [16, 22, 34, 36, 47]. В последние годы эти микроорганизмы привлекают особое внимание, так как являются возбудителями опасных внутри-больничных легочных инфекций у больных му-ковисцедозом, хроническим гранулематозом и у иммунокомпрометированных пациентов.
Буркхолдерии способны к образованию биопленок не только на органах и тканях, препятствуя проникновению антибиотиков, но и на различных поверхностях медицинских стационаров (эндопротезах, линзах, оборудовании, инструментарии и др.), что увеличивает их эпидемиологическую значимость [19, 20].
В природных условиях участие B. cenocepacia, как и свободноживущих простейших, в формировании биопленок неизвестно. Приступая к экспериментальному изучению этого, мы отталкивались от ранее изученных взаимодействий планктонных популяций Pseudomonas (Burkholderia) cepacia со свободноживущими инфузориями Tet-rahymena pyriformis на популяционном, клеточном и ультраструктурном уровнях [14]. Культивирование этих бактерий с тетрахименами в оптимальных условиях (сердечно-мозговой бульон, рН 7.6, температура 25°С) на протяжении 9 суток показало, что темпы размножения бактерий достаточно высоки, чтобы компенсировать частичное их выедание инфузориями (105 КОЕ/мл, близкая к исходной - 2 х 105 КОЕ/мл).
Детальное изучение бактериально-протозой-ной ассоциации в динамике (от 15 мин до 24 ч) методом трансмиссионной электронной микроскопии выявило следующее. Уже в первые минуты
контакта отмечался высокий уровень фагоцитоза, причем отдельные особи простейших формировали до 50 и более фагосом, заполненных бактериями. Цитоплазма клетки-хозяина содержала митохондрии и лизосомоподобные гранулы, чаще свободные от содержимого, что свидетельствует об энергетическом и ферментном обеспечении эукариотной клеткой процесса переваривания микробной массы. В более поздние сроки (от 4 до 8 ч) во многих фагосомах наблюдалась деструкция большинства бактериальных клеток, однако единичные бактерии оставались интакт-ными и начинали делиться. Через сутки взаимодействия простейшие значительно увеличивались в размерах за счет слияния нескольких фагосом в гигантские, происходили их разрывы, через которые бактерии выпадали во внеклеточное пространство, приводя к гибели клетку-хозяина.
Полученные бактериологические и цитологические результаты свидетельствуют о том, что исход взаимодействия инфузорий с B. cepacia в планктонных сообществах складывается в пользу последних, демонстрируя паразитизм этих бактерий в простейших. Как резервуарные хозяева простейшие обеспечивают существование бурк-холдерий на определенном уровне численности популяции в биоценозах почв и водоемов [14, 32].
Сохраняются ли эти закономерности в биопленочных сообществах и вносят ли простейшие какой-либо вклад в формирование биопленок бактериями? Этим вопросам были посвящены экспериментальные исследования, описанные ниже.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культивирование B. cenocepacia 370, геномо-вар IIIa (выделены от больного пневмонией в госпитале им. H.H. Бурденко) проводили в жидкой и плотной питательных средах: Luria-Bertani (LB), цитримидном (СА) агаре, а полученный нами мутант bcb++ с повышенной способностью к формированию биопленки (см. результаты) - с добавлением канамицина и ампициллина в концентрации 100 мкг/мл среды. Биохимические свойства изо-генной пары B. cenocepacia (370 и bcb++) сравнивали на тест-системах API 20NE (Bio-Merieux, Франция).
Получение мутантов B. cenocepacia c измененной способностью образования биопленки
Мутанты исходного штамма B. cenocepacia 370 получали методом случайного инсерционного мутагенеза с помощью пласпозона мини-Тп5. Ночные культуры реципиентного штамма буркхолде-рий и донорного штамма Escherichia coli, несущего пласпозон pTnMod-RKm5, разводили в 50 раз LB-бульоном и инкубировали при качании 1.5 ч
при 30°С. Равные объемы реципиентного и до-норного штаммов смешивали, встряхивали на вортексе, осаждали смесь центрифугированием и разводили в 10 раз уменьшенным объемом свежего LB-бульона. Концентрированную смесь наносили на нитроцеллюлозные фильтры по 100 мкл и помещали на поверхность агара в чашках Петри для инкубации в течение ночи при 30°С. Выросшие колонии собирали в бульон и без разведения высевали на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин в конечной концентрации 100 мкг/мл для предотвращения роста донорного штамма E. coli и канамицин (100 мкг/мл) для предотвращения роста реципиентного штамма B. cenocepa-cia. На селективной среде получены инсерцион-ные мутанты исходного штамма с последующей тотальной проверкой всех клонов на их способность к образованию биопленок [15]. Изолированные мутанты различались по эффективности образования биопленок; для данных экспериментов был выбран мутант с повышенной способностью к формированию биопленки (B. cenocepacia bcb++).
Моделирование бактериалъно-протозойного сообщества
Участие каких-либо простейших
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.