БИОФИЗИКА, 2013, том 58, вып. 1, с. 90-96
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.3:577.121.7
ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ СТРУКТУРНЫМ СОСТОЯНИЕМ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИМИ СВОЙ СТВАМИ И СОСТАВОМ ЛИПИДОВ В КЛЕТКАХ МИКРООРГАНИЗМОВ
© 2013 г. Л.Н. Шишкина, А.Н. Капич, В.А. Меньшов, А.Н. Голощапов
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биох имической физики им. Н.М. Эмануэля Pоссийской академии наук, 119334, Москва, ул. Косыгина, 4 E-mail: shishkina@sky.скрк.ras.ru Поступила в p едакцию 28.02.12 г.
Проведено комплексное изучение антиоксидантных свойств и состава липидов пяти грамот-рицательных бактерий в зависимости от сезона культивирования, а также структурного состояния, состава и физико-химических свойств липидов трех штаммов грамотрицательных бактерий (Renoba£ter varnolatum, Пе^оЪасШш major WKM 869, Pseudomonas fluorescens) в процессе их роста и мицелия четырех культур ксилотрофных базидиомицетов (Panus tigrinus ИБК-131, Fomes fomentarius М71, Laetiporus sulfureus М131, Piptoporus betulinus М60) в фазе замедления роста. Выявлены значительные структурные перестройки мембранной системы изученных штаммов в процессе роста бактерий, обусловленные изменениями состава их липидного компонента. Показана основная роль более гидрофильных областей липидного компонента в обеспечении текучести всего липидного слоя мицелия базидиомицетов. Масштаб и направленность выявленных взаимосвязей между временами вращательной корреляции зондов и составом липидов зависят как от локализации зонда в бислое, так и от состава и физико-химических свойств липидов микроорганизмов.
Ключевые слова; липиды, грамотрицательные бактерии, ксилотрофные базидиомицеты, перекисное окисление, ЭПP.
Известно, что клеточные регулятор ные механизмы у микроор ганизмов играют более значительную роль и проявляются отчетливее, чем у более сложных биологических объектов. Воздействие на микр оорганизмы различных неблагоприятных факторов окружающей среды во многих случаях создает предпосылки для активации в них пр оцессов пер екисного окисления липидов (ПОЛ) [1-6]. Существование физико-химической системы регуляции, обеспечивающей протекание процессов ПОЛ на стационарном уровне, было показано в мицелии ксилотрофных базидиомицетов [7] и клетках винных дрожжей различных таксономических групп и в разных физиологических состояниях [8]. Однако именно на уровне микробных клеток изучению механизма функционирования физико-
Сокращения: ПОЛ - перекисное окисление липидов; АОА - антиокислительная активность; АПА - антипе-роксидная активность; ФЛ - фосфолипиды, ЛОФЛ - более легкоокисляемые фракции фосфолипидов; ТОФЛ - более трудноокисляемые фракции фосфолипидов; ФС - фосфа-тидилсерин, ФИ - фосфатидилинозит, ФЭ - фосфатиди-лэтаноламин, ФГ - фосфатидилглицерин, КЛ - кардио-липин, ФК - фосфатидная кислота, ЛФХ - лизоформы ФЛ, СМ - сфингомиелин, ФХ - фосфатидилхолин, АО -антиоксидант; ЖК - жирные кислоты.
химической системы регуляции ПОЛ уделяется меньше внимания, чем в клетках и тканях млекопитающих.
Целью работы являлось комплексное изучение состояния параметров физико-химической системы регуляции ПОЛ в клетках разных штаммов грамотрицательных бактерий и мицелия ксилотр офных базидиомицетов с использованием различных биофизических и биохимических методов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования являлись липиды пяти штаммов грамотрицательных бактерий (Renobacter varnolatum, FlectobacШus major wKm 869, Pseudomonas fluorescens, M ethyloba^erium organophilum NP-220, Arcocella aquatwa 502) и мицелия четыр ех культур ксилотр офных базидиомицетов (Panus tigrinus ИБК-131, Fomes fomentarius М71, Laetiporus sulfureus М131, Piptoporus betulinus М60). Условия культивирования штаммов бактерий подробно изложены в работах [9,10], а мицелия ксилотрофных базидиомицетов - в работе [7].
ВЗАИМО СВЯЗЬ МЕЖДУ C ТРУКТУРНЫМ C О C ТОЯНИЕМ
91
P ис. 1. С тр уктур ные фор мулы спиновых зондов.
Липиды выделяли по методу Блая и Дайер а в модификации Кейтса [11]. Величину антиокислительной активности (АОА) липидов оп-р еделяли на метилолеатной окислительной модели при температуре 37,0 ± 0,1°C [12]. За ходом окисления следили по количеству обр азующих-ся пер оксидов, ур овень котор ых опр еделяли йодометр ически. За величину пер иода индукции окисления принимали время, при котором концентр ация пер оксидов в системе до стигала зна -чения 0,02 ммоль/г, в качестве стандар та выбр ан метилолеат со скор о стью зар ождения р адика-лов 2,9-10-10 моль/л-с [13]. C пособность липидов р азлагать пер оксиды, т .е. их антипер оксидную активность (АПА), и/или содержание пер оксидов в липидах оценивали по методикам, ука-занным в работе [13].
Качественный и количественный состав фос-фолипидов (ФЛ) опр еделяли методом тонкослойной хр оматогр афии [14], используя силика-гель типа G (Sigma, США), стеклянные пластинки размер ом 9 х 12 см, смесь ра створ ителей хлороформ:метанол:ледяная уксусная кислота: вода в соотношении 60:50:1:4 в качестве подвижной фазы [14]. Методика анализа со става ФЛ подробно изложена в работе [8]. Помимо количественного содержания различных фракций фосфолипидов, оценивали и такие обобщенные показатели со става, как доля ФЛ в со ставе общих липидов (%ФЛ), соотношение сумм более легкоокисляемых и более трудно -окисляемых фр акций ФЛ (ХЛОФЛ/ХТОФЛ), котор ое характеризует способность липидов к окислению и вычисляется по формуле [15]:
2ЛОФЛ/ГТОФ Л = (Ф C + ФИ + ФЭ + ФГ + + К Л + ФК)/(ЛФХ + СМ + Ф X),
где Ф С - фо сфатидилсер ин, ФИ - фо сфатиди-линозит, ФЭ - фосфатидилэтаноламин, ФГ -фо сфатидилглицер ин, КЛ - кар диолипин, ФК -фо сфатидная кислота, ЛФХ - лизофор мы ФЛ, СМ - сфингомиелин, ФX - фосфатидилхолин.
Текучесть липидного компонента мембран клеток бактер ий и мицелия базидиомицетов исследовали методом слабосвязанных пар амагнит-ных зондов, локализующихся в различных областях мембр ан. В качестве зондов использовали стабильные иминоксильные радикалы: 2,2,6,6-тетр аметил-4-капр илоилоксипипер идин-1-оксил (зонд 1, локализуется в более гидрофобных областях фо сфолипидного компонента мем-б р ан); 5,6-бензо-2,2,3,3-тетр аметил-1,2,3,4-тетр а -гидр о -у-кар болин-3-оксил (зонд 2, локализуется в более гидрофильных областях фосфолипидов мембр ан); 2,2,4,5,5-пентаметил-1-гидр окси-3-имидозолин-3-оксид (зонд 3, химические свойства его [16] позволяют пр едположить локализацию по в сему липидному компоненту мембр аны). Работа с зондами осуществлялась в соответствии с разработанным для клеточных о р ганелл методом [17]. Структур ные фо р мулы зондов п р ед ставлены на р и с. 1. Р еги ст р ацию спектр ов ЭП Р пр оводили пр и комнатной темпер атур е на радиоспектр ометр е ЭП Р E4 Varían (Вгискег, Гер мания). Концентр ация зондов в кювете составляла 10-6 М на (4 ^ 6)107 клеток. Величины времен вращательной корреляции зондов рассчитывали по общепринятой для бы-
Сезонная вариабельность содержания липидов, доли в них фосфолипидов и величины АОА липидов грамотрицательных бактерий (стационарная фаза роста)
Штамм Общие липиды, мг/г АСД Доля фосфолипидов в составе общих липидов, % АОА липидов, ч-мл/г
Опыт № 1 Опыт № 2 Опыт № 1 Опыт № 2 Опыт № 1 Опыт № 2
R. vacuolatum 9,9 5,7 24,7 ± 0,8 30,0 ± 1,7 - 4815 - 4560
M. organophilum NP-220 7,9 17,5 28,0 ± 0,3 9,5 ± 0,1 - 2715 - 330
P. fluorescence 11,3 4,75 39,1 ± 1,5 41,8 ± 2,0
F. major 33,3 5,1 25,9 ± 3,0 6,45 ± 0,8 - 265 - 310
A. aquatica N0-502 6,4 0.5 27,7 ± 0,75 30,0 ± 0,9 - 350
стро вращающихся зондов формуле [18]: тс = 6,65 х АН х (V/+1/T-7 - 1)10-10 с.
Статистическую обработку результатов проводили общепр инятыми методами вар иаци-онной статистики [19] и с помощью пакета компьютерных программ KINS [20].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Общеизвестны как высокая лабильность липидов, так и существенная сезонная вариабельность их антиокислительной активности и со -става, интенсивности пр оцессов ПОЛ в тканях млекопитающих [12,13,21,22]. Анализ АОА и состава липидов грамотрицательных бактерий также свидетельствует о высокой лабильности их липидного компонента в зависимости от сезона культивирования и штамма. Это следует из данных о существенных различиях содержания общих липидов в р асчете на грамм сухой массы клеток, доли ФЛ в составе общих липидов и величин АОА липидов разных штаммов в стационарной фазе ро ста (таблица) при про -ведении экспериментов в разные сезоны: опыт № 1 проводили в весенний (март и апр ель), а опыт № 2 в летний (июнь) сезоны.
В липидах исследованных штаммов обнаружены незначительные количества пероксидов, в то время как липиды бактерий M. organop-hilum и F. major обладали антипероксидной активностью. Анализ кинетических кривых накопления пероксидов при окислении метило-леата в присутствии липидов бактерий с помощью пакета программ KINS показал, что они удовлетворительно описываются экспоненциальной зависимостью (R > 0,98 во всех случаях), что ранее было показано и для липидов из тканей млекопитающих [13]. Присутствие ли-пидов в субстрате окисления оказывает выра -женное влияние и на величину предъэкспонен-циального множителя, и на показатель экспоненты, что свидетельствует об участии липидов
бактерий в процессах низкотемпературного автоокисления метилолеата на стадиях зарождения радикалов и продолжения цепи. Необхо-димо отметить, что липиды всех изученных штаммов грамотрицательных бактерий обладали пр ооксидантными свойствами пр и действии на метилолеатной окислительной модели, т.е. ускоряли окисление метилолеата (таблица). При этом обнаружены обратные корреляционные зависимости между величинами антиокислитель -ной активности липидов и изменением величины предъэкспоненциального множителя относительно аналогичного значения для метило-леата, если липиды обладали антипероксидной активностью (R = - 0,985 ± 0,02), и относительным увеличением показателя экспоненты (R = - 0,95 ± 0,05), если в липидах обнаружены пероксиды.
Как показано ранее [13,23], прооксидантный эффект липидов может быть обусловлен как низким содержанием в них антиоксидантов (АО), так и высокой степенью ненасыщенности липидов. При исследовании состава жирных
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.