ВЗАИМОСВЯЗЬ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ ИСТОЧНИКА АЗОТА И АКТИВНОСТИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛЕКТИНОВ ПРИ ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ LENTINUS EDODES (BERK.) SING [LENTINULA EDODES (BERK.) PEGLER]

ГАРИБОВА Л.В.; НИКИТИНА В.Е.; ПАНКРАТОВ А.Н.; ЦИВИЛЕВА О.М.

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 4, с. 486-490

= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =

УДК 582.28:57.083

ВЗАИМОСВЯЗЬ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ ИСТОЧНИКА АЗОТА И АКТИВНОСТИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛЕКТИНОВ ПРИ ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ LENTINUS EDODES (BERK.) SING [LENTINULA EDODES (BERK.) PEGLER]

*Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов **Кафедра аналитической химии и химической экологии химического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского ***Кафедра микологии и альгологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 09.06.03 г.

Впервые показано, что активность внеклеточных лектинов Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler] и появление пигментированной мицелиальной пленки в глубинной культуре зависит от присутствия в синтетической среде важнейших аминокислот. Обнаружен выраженный эффект аспара-гина в присутствии катионов Ca2+ или Mn2+ на формирование указанной вегетативной структуры. Примененные методы квантовой химии и QSAR подтверждают предположение о том, что дифференциальный характер взаимодействия изученных аминокислот с катионами Ca2+, Mn2+ связан не с различиями в электронном строении цвиттер-ионов, а, вероятнее всего, с их разной гидрофобностью.

Ключевые слова: лектины высших грибов, глубинное культивирование, Lentinus edodes, аминокислоты, молекулярная структура, квантово-химическое исследование.

В рамках изучения биохимических аспектов развития Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler], или шиитаке, особый интерес представляет исследование лектинов, упоминание о которых для этого базидиомицета в литературе ограничивалось работой [1], касающейся выделения лектина из плодового тела. Ранее нами проводились исследования лектиновой активности L. edodes в зависимости от различных факторов, в том числе, состава среды жидкофазного и твердофазного культивирования, от стадии морфогенетического развития культуры [2, 3]. Изучение лектиновой активности на стадиях образования различных вегетативных структур представляет особый интерес. Настоящая работа посвящена исследованию в этом аспекте коричневой мицелиальной пленки (МП), которая, как известно, характерна для шиитаке и предшествует плодоношению [4].

Целью работы явилось изучение взаимосвязи активности внеклеточных лектинов L. edodes F-249, формирования МП в глубинной культуре и природы источника азота в синтетической среде выращивания.

1 Адресат для переписки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использован штамм ЬвМтш edod.es Б-249 из коллекции высших базидиальных грибов каф. микологии и альгологии Московского государственного университета. Культуры грибов поддерживали на сусле-агаре при 4°С. При глубинном культивировании Ь. edodes использовали синтетические среды на основе Д-глюкозы (50 мМ) с источниками азота: хлоридом аммония или нитратом натрия (соотношение углерод : азот в среде составляло от 7.5 : 1 до 150 : 1); необходимыми аминокислотами (20 мМ по азоту). В качестве компонентов - добавок к среде выращивания использовали катионы Са2+ или Мп2+ в виде хлоридов.

Температура выращивания: 26°С как оптимальная температура роста мицелия для данного вида [5].

Инокуляцию жидких сред осуществляли стандартными блоками, вырезанными из зоны роста колонии штамма на агаризованном пивном сусле [6], из расчета 3 диска диаметром 5 мм на 50 мл среды.

Гемагглютинирующую активность жидких сред определяли реакцией гемагглютинации с самопроизвольным оседанием эритроцитов, используя 2%-ную суспензию трипсинизированных кроличьих эритроцитов в серии последовательных разведений лектина [7]. Титр гемагглютинации

ВЗАИМОСВЯЗЬ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ ИСТОЧНИКА АЗОТА

487

(ТГА) выражали как наибольшее разведение раствора, вызывающее агглютинацию эритроцитов.

Ab initio расчеты методом Хартри-Фока в базисе 6-31G* [8] проводили по программе из пакета HyperChem [HyperChem (TM), Hypercube, Inc., 1115 NW 4th Street, Gainesville, Florida 32601, USA] с полной оптимизацией геометрии с использованием алгоритма Полака-Рибера [9]. При квантово-химических расчетах задавали условие, чтобы норма градиента не превышала 0.02 ккал/(моль А).

Математическую обработку результатов исследования проводили общепринятым методом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Участие лектинов в формировании МП L. edod.es подтверждается рядом экспериментов, проведенных нами ранее.

При изучении лектиновой активности экстрактов из мицелия шиитаке, выращенного на различных агаризованных средах, и связи этой активности с дальнейшим формированием плодовых тел на данных средах оказалось, что чем выше лектиновая активность мицелия, тем быстрее формируется МП [3].

При проведении экспериментов по определению лектиновой активности на различных стадиях морфогенеза нами было показано, что при получении плодовых тел L. edodes F-249 как на чашке Петри с агаризованным пивным суслом, так и на субстрате "дубовые опилки-зерно" отмечается значительное увеличение лектиновой активности на этапе МП по сравнению с мицелием и дальнейшее снижение активности на стадиях примордиев и плодовых тел. Формирование МП приводит к резкому увеличению ТГА экстрактов из исследуемых морфологических структур [3].

В настоящей работе предприняты попытки получения МП на жидких синтетических средах. Оптимизировали среду выращивания в отношении лектиновой активности. Для этого определяли в динамике величины ТГА культуральной жидкости при использовании источников азота разной природы. В табл. 1 и 2 приведены соответствующие данные для различных мольных соотношений углерода и неорганического азота в среде культивирования. Из табл. 1, 2 видно, что лектиновая активность наиболее высока в случае аммонийного азота при соотношении C : N, равном 150 : 1.

Данные табл. 3 характеризуют лектиновую активность жидкой культуры при использовании аминокислотного источника азота для различных мольных соотношений углерод : азот в среде культивирования. Как видно из табл. 3, активность внеклеточных лектинов L. edodes F-249 высока для сред с органическим азотом (ТГА достигает значения 4096 при соотношении C : N, рав-

Таблица 1. Максимальные значения ТГА в зависимости от соотношения "углерод : азот" в среде культивирования Ь. ейойе* Б-249 с Ш4С1*

С : N

150 : 1 75 : 1 30 : 1 12.5 : 1 7.5 : 1

1024 64 64 64 64

(13) (1, 9-27) (1, 13-27) (13-27) (13-27)

* В скобках указан возраст глубинной культуры (сут).

Таблица 2. Максимальные значения ТГА в зависимости от соотношения "углерод : азот" в среде культивирования Ь. ейойе* Б-249 с NaNО*

СГк

150 : 1 75 : 1 30 : 1 15 : 1 10 : 1 7.5 : 1

512 512 128 128 512 256

(1-3, 7, (7, 11) (1-3, (1-3, 7, (3) (3)

11-14) 7-17) 11-17)

* В скобках указан возраст глубинной культуры (сут).

Таблица 3. Максимальные значения ТГА в зависимости от соотношения "углерод : азот" в среде культивирования Ь. ейойе* Б-249 с Ь-аспарагином*

С : N

152 : 1 77 : 1 32 : 1 17 : 1 12 : 1 9.5 : 1

128 1024 1024 4096 1024 1024

(1-9) (3-7) (1-7) (3-7) (3-7) (1-7)

* В скобках указан возраст глубинной культуры (сут).

ном 17 : 1). Однако появление МП наблюдалось только после 55-60 сут культивирования.

Мы попытались получить МП Ь. ейойез Б-249 с использованием некоторых добавок к синтетической среде. Обнаружен положительный эффект катионов Са2+ (2-10 ммоль/л) или Мп2+ (0.52 ммоль/л). В отсутствие аминокислотного источника азота не обнаружено влияния этих катионов на появление МП. Среди изученных нами важнейших аминокислот выражено действие аспара-гина на процесс образования МП в жидкой среде культивирования. То есть имеет место явный эффект двузарядных катионов кальция или марганца и аспарагина при их одновременном присутствии на процесс формирования МП в глубинной культуре.

Естественно предположить, что аспарагин участвует в определенных биохимических процессах, медиированных ионами кальция(П) и марган-ца(11). Но ограничено ли отличительное действие аспарагина как компонента жидкой питательной среды только участием в химическом связывании в растворе? Если это так, то по электронному

Заряды на атомах цвиттер-ионов аминокислот, полученные по данным ИНБ/б-ЗШ* расчетов в рамках анализа орбитальных заселенностей по Малликену [8].

строению молекулы аспарагин должен выделяться даже среди структурно близких аминокислот. В то же время известно, что углеводы взаимодействуют с лектинами, в том числе, посредством образования множественных водородных связей, при этом амидный водород и карбонильный кислород аспарагина в структуре сайтов связывания часто включены в это белок-углеводное взаимодействие [10]. К рассмотрению данной проблемы нами привлечены методы квантовой химии.

Возникает предположение, что реакционным фрагментом аспарагина служит амидная группировка. Косвенным доводом в пользу обратимого взаимодействия аспарагина с катионом металла по первичной амидной группе, а не хелатообразо-вания с участием аминной и карбоксильной функций служит то, что последний из упомянутых процессов характерен, в большей степени, для такого катиона, как медь(11), и не столь известен для катионов кальция и марганца(П) [11]. Вследствие сопряжения в амидной группе нуклеофильные свойства азота существенно понижены. Наиболее вероятным центром связывания катиона металла является атом кислорода. Это вытекает также из принципа жестких и мягких кислот и оснований [12]: предпочтительно взаимодействие жесткой кислоты Льюиса - катиона кальция или марганца(П) с жестким реакционным центром -кислородным атомом. Если реакционным фрагментом является СООН-группа, то связывание металла по кислородному атому не имеет альтер-

нативы. Жестко-жесткое взаимодействие является зарядово-контролируемым [12].

Глутамин - ближайший структурный аналог аспарагина и единственная из исследованных нами аминокислот, помимо аспарагина, имеющая в своем составе группу CONH2. Хотя молекула глу-тамина отличается от молекулы аспарагина только одним метиленовым звеном, тем не менее, глутам

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.