ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА, 2004, том 30, № 5, с. 97-103
УДК 612.821
ВЗАИМОСВЯЗЬ ОКСИДА АЗОТА С МАЛОНОВЫМ ДИАЛЬДЕГИДОМ И АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЩИМ ФЕРМЕНТОМ В НОРМЕ И ПРИ РАНЕНИЯХ ГРУДИ
© 2004 г. П. П. Голиков, Н. Ю. Николаева, Б. В. Давыдов, Е. В. Клычникова, А. Н. Погодина, Е. Б. Николаева, М. М. Абакумов
НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, Москва Поступила в редакцию 01.10.2003 г.
У больных с ранением груди (53 пациента, тяжесть состояния - 8-15 баллов по APACHE II) изучена взаимосвязь оксида азота (NOx) с ангиотензинпревращающим ферментом (ACE) и малоновым ди-альдегидом (МДА) в сыворотке крови через 1, 3, 7 и 14 суток после ранения груди (основная группа). Контролем служили 20 доноров. Через 1 сутки после ранения груди обнаружено достоверное повышение уровня NOx, активности ACE и содержания МДА. В последующие сроки исследования уровень NOx и активность ACE снижались, а содержание МДА увеличивалось. В контрольной группе обнаружена отрицательная достоверная корреляция между NOx и МДА и положительная достоверная корреляция между NOx и ACE. Через 1 сутки после травмы груди отмеченная в контроле корреляция утрачивается, но восстанавливается через 3 суток. Следовательно, травма груди сопровождается повышением уровня NOX и МДА, определяющих интенсивность окислительного стресса. Положительная корреляция между NOX и ACE в контрольной и основной группах свидетельствует об их сопряженности в регуляции физиологических функций и метаболических процессов.
Расслабляющий сосуды фактор - оксид азота (N0) играет важную роль в физиологических и патологических процессах организма [1-3]. За сравнительно короткий период, прошедший с момента открытия ангиотропной функции оксида азота, накоплен большой экспериментальный и клинический материал, позволивший установить субстрат биосинтеза оксида азота, ферменты и изоферменты, принимающие участие в биосинтезе оксида азота, тканевую специфичность изо-ферментов синтазы оксида азота, обнаружить сопряженность эффектов оксида азота и супероксидного анион-радикала в реализации окислительного стресса [4, 5]. Оксид азота, как нейроме-диатор, осуществляет синаптическую передачу от пре- к постсинаптическому нейрону, воздействуя на клетки глии и окружающие нейроны. В физиологических условиях нейрональный оксид азота защищает головной мозг от ишемических и нейротоксических воздействий, обладает анти-атерогенными свойствами, тогда как в условиях патологии может усиливать патологические процессы в головном мозге [6, 7].
Оксид азота, как одна из реактивных форм кислорода, играет важную роль в механизме инициации окислительного стресса [8]. Одним из важных механизмов, ответственных за повышение продукции супероксидного анион-радикала и N0, является гипоксия [9]. При этом токсическое действие кислородных радикалов усиливается со-
пряженной реакцией супероксидного анион-радикала с оксидом азота с образованием пероксинит-рита (ONOO), который значительно интенсивнее, чем супероксидный анион-радикал или оксид азота, вызывает повреждение клеточных структур, мутацию ДНК, интенсивный апоптоз [10, 11]. В клинических исследованиях отмечено одновременное повышение уровня нитрита/нитрата и уровня малонового диальдегида (МДА) в крови у больных с каротидной эндартериоэктомией, что свидетельствует об усилении окислительного стресса [12]. В эксперименте показано, что ангио-тензинпревращающий фермент (ACE) и ангио-тензин Ii стимулируют биосинтез оксида азота [13, 14]. Эти данные имеют принципиальное значение в выяснении патогенетических механизмов окислительного стресса, в котором роль оксида азота становится все более значимой.
В данном исследовании изучена взаимосвязь оксида азота с МДА и ACE у больных с ранением груди с целью обоснования патогенетической терапии этих больных.
МЕТОДИКА
Исследования проведены у 53 больных с ранениями груди в возрасте от 24 до 67 лет (33 ± 2 года) (основная группа) и у 20 здоровых лиц в возрасте от 18 до 46 лет (28 ± 1.6 года) (контрольная группа). Согласно шкале тяжести состояния APACHE II
[15], пострадавшие с ранениями груди имели сумму баллов от 8 до 15. Большее количество баллов соответствует более тяжелому состоянию. Оценка тяжести состояния пострадавших проводилась в момент поступления в реанимационное отделение. Исследование метаболитов в основной группе проведено на 1, 3, 7 и 14-е сутки после ранения.
Определение стабильных метаболитов оксида азота - нитрита/нитрата (NOx) в сыворотке крови проводили по методу, согласно которому кадмий в присутствии цинка восстанавливает нитрат до нитрита [16]. При этом был использован ранее разработанный нами способ освобождения белка из сыворотки крови, применяемый при определении содержания нитрита в сыворотке крови. С этой целью пробы сыворотки крови замораживали и хранили при -30°С до измерения. Перед определением образцы сыворотки крови оттаивали и депротеинизировали добавлением 0.8 мл 0.5 N NaOH и 0.8 мл 10% раствора сульфата цинка к 0.4 мл сыворотки. Содержимое пробирки перемешивали (30 с) и центрифугировали 15 мин при 9000 g. При этом содержание белка в пробах не превышало 20-50 мг/л [17]. Восстановление нитрата до нитрита в освобожденных от белка пробах проводили с помощью гранулированного кадмия (массовая доля гранулированного кадмия >99.96%). Предварительно гранулы кадмия промывали би-дистиллированной водой, 0.1 N HCl и снова - би-дистиллированной водой до нейтральной среды. Надосадочную жидкость (1.5 мл) смешивали с равным объемом реактива Грисса (1% сульфаниламид, 0.1% нафтилендиамин, 2.5% фосфорная кислота) [18] и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Измерение абсорбции раствора проводили на спектрофотометре при длине волны 546 нм [19]. Концентрацию NOx в сыворотке крови определяли с помощью стандарта. В качестве стандарта использовали нитрит натрия [20].
При определении активности ACE исследуемую сыворотку вносили в 2 пробирки по 0.02 мл. Затем в одну пробирку добавляли 0.1 мл раствора субстрата - фурилакрилоилфенилаланинглицил-глицина (ФАПГГ) в концентрации 1 мМ (опыт), в другую - 0.1 мл 20 мМ этилендиамидтетрауксус-ной кислоты (ЭДТА) (контроль). Пробы инкубировали в термостате при 37°С 30 мин. Затем пробирки помещали в ледяную баню и в одну из них добавляли 0.1 мл 20 мМ ЭДТА (опыт), а в другую - 0.1 мл раствора субстрата (контроль), тщательно смешивали. Через 5 мин в обе пробирки вносили по 2.3 мл буферного раствора (50 мМ трис-(оксиметил)-аминометана, 300 мМ хлорида натрия, рН 8.3) и измеряли на спектрофотометре оптическую плотность проб при 334 нм против дистиллированной воды. При этом экстинкция раствора контрольной пробы отражала исходный уровень абсорбции ФАПГГ, а экстинкция раствора опытной пробы свидетельствовала об уровне
снижения абсорбции ФАПГГ в результате гидролиза субстрата ферментом до фурилакрилоилфе-нилаланина и глицилглицина. Различие в экс-тинкции между контрольной и опытной пробами указывает на активность ACE [21].
Определение содержания МДА в сыворотке крови проводили спектрофлуориметрическим методом, согласно работе [22]. Для проведения анализа в стеклянную пробирку (опыт) вносили 0.1 мл сыворотки крови, 1.5 мл 1% ортофосфор-ной кислоты (рН = 2.0) и 0.5 мл 0.67% тиобарби-туровой кислоты (фирмы "Sigma", США). Пробирку встряхивали. В контрольную пробирку вместо сыворотки вносили 0.1 мл дистиллированной воды. Затем опытные и контрольные пробирки инкубировали 45 мин на кипящей водяной бане. После этого пробирки охлаждали в токе холодной воды до комнатной температуры, добавляли в каждую из них по 2 мл н-бутанола и содержимое пробирок интенсивно перемешивали на горизонтальном встряхивателе под углом 45° в течение 15 мин. Разделение фаз осуществляли центрифугированием при 1500 g в течение 10-15 мин. Для исследования брали верхнюю бутанольную фазу. При определении концентрации МДА записывали спектр флуоресценции бутанольного экстракта на спектрофлуориметре "RF-5000" фирмы "Shimadzu" (Япония) при ^возб = 515 нм. Об уровне МДА судили по интенсивности флуоресценции при ^фл = 545 нм. Для приготовления стандартной пробы (эталон) в реакционую смесь добавляли вместо воды 0.1 мл 5 х 10-6 М раствора 1,1,3,3-те-траметоксипропана (фирма "Merck", Германия), что соответсвует содержанию 1 нмоль МДА в пробе. Далее все этапы проводились так же, как с опытными и контрольной пробами. Концентрацию МДА рассчитывали по формуле:
F - F
C -r-F a
CT к
где F0, FK и FCT - интенсивность флуоресценции опытной, контрольной и стандартной проб, соответственно; A - концентрация МДА стандартного раствора (1 мкмоль/л).
Результаты обработаны методом вариационной статистики [23] и методом ранговой корреляции Спирмена на компьютере Pentium-100 в операционных стандартах Windows 97 с помощью лицензионной копии Microsoft Excel 97. Различия были достоверны при р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Согласно полученным данным (таблица), у больных через 1 сутки после ранения груди в сы-
воротке крови из локтевой вены обнаружено достоверное повышение уровня NOx (43.1 ± 2.9; норма - 26.2 ± 1.1 мкмоль/л,p < 0.05), активности ACE (43.4 ± 2.0; норма - 35.0 ± 1.5 мкмоль/мин/л, p < < 0.05) и содержания МДА (2.16 ± 0.19; норма -1.24 ± 0.07 мкмоль/л, p < 0.05), что является свидетельством выраженного окислительного стресса у больных с ранением груди. В последующие сроки исследования содержание NOx в сыворотке крови хотя и снижалось, однако на 3, 7 и 14-е сутки после ранения груди было достоверно выше контрольного. Активность ACE спустя трое суток после ранения груди и в последующие сроки нормализовалась. При этом отмечалась динамическая тенденция постепенного снижения активности ACE к 14-м суткам после ранения груди. Динамика содержания МДА имела противоположную направленность по сравнению с динамикой содержания NOx и активностью ACE. Максимальное содержание МДА отмечено на 14-е сутки после ранения груди, хотя и на 1-е, и на 3-и, и на 7-е сутки содержание МДА было достоверно выше контрольного (таблица).
Обнаруженная различная динамика направленности уровня NOx и ACE, с одной стороны, и уровня NOx и МДА - с другой, явил
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.