РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2015, том 9(18), № 1, с. 63-70
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ВЗАИМОСВЯЗИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ИММУННЫХ РЕАКЦИЙ НА ХИМИЧЕСКИЕ КАНЦЕРОГЕНЫ И СТЕРОИДНЫЕ ГОРМОНЫ
У БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН
© 2015 г. А.Н. Глушков1,2, К.С. Красильникова1, Е.Г. Поленок1,2, Л.А. Гордеева1
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии человека Сибирского отделения РАН, Отдел молекулярной экологии человека, 650065 Россия, г. Кемерово, пр. Ленинградский 10;
2 ФГБОУ ВПО "Кемеровский государственный университет"
Поступила: 11.06.2014. Принята: 15.01.2015
Исследовали гаптен-специфические иммунные реакции на химические канцерогены окружающей среды и стероидные гормоны у беременных женщин. Обнаружили, что содержание антител к эстрадиолу и прогестерону в сыворотке крови коррелирует с уровнями антител к бензо[а]пирену. Взаимосвязи уровней указанных антител при врождённых пороках развития плода имеют характерные особенности. Полученные результаты подтверждают ранее высказанное предположение о дисбалансе иммунных реакций на низкомолекулярные ксено- и эндобиотики при тератогенезе.
Ключевые слова: беременность, антитела, бензо[а]пирен, эстрадиол, прогестерон, врождённые пороки развития плода
ВВЕДЕНИЕ
Ранее предполагалось, что гаптен-специфи-ческие иммунные реакции на низкомолекулярные органические ксено- и эндобиотики взаимосвязаны, поскольку они развиваются в ответ на появление макромолекулярных аддуктов их метаболитов, образующихся под действием одних и тех же ферментов биотрансформации [1, 2]. В частности, аддукты бензо[а]пирена (БП) и эстрогенов с ДНК и белками обнаружены в различных тканях организма человека [3, 4], в том числе, плаценте [5 — 7], а также в сыворотке крови беременных женщин, плодов и новорожденных детей [8—12]. Выявлены ассоциации генетических полиморфизмов ферментов биотрансформации CYP и GST с количеством аддуктов [13, 14], в том числе, в сыворотке крови беременных женщин и плодов [15, 16], а также влияние GST матери на развитие ребёнка при воздействии БП [17].
Особый интерес к иммунным реакциям на химические канцерогены (тератогены) об-
Адрес: 650065 Россия, г. Кемерово, пр. Ленинградский 10, Глушкову Андрею Николаевичу. E-mail: ihe@list.ru
условлены тем, что антитела (АТ) способны модулировать их проникновение из окружающей среды через эпителиальные ткани в кровь [18, 19] и распределение их по разным органам [20]. Поэтому весьма вероятно, что АТ, связывая химические канцерогены, их метаболиты и аддукты с белками в сыворотке крови матери, препятствуют их проникновению в организм плода через плаценту и снижают их известные эмбриотоксические эффекты — врождённые пороки и хромосомные нарушения [21, 22].
С другой стороны, в многочисленных экспериментах на животных показано, что индукция синтеза АТ к эстрадиолу (ЭС) и прогестерону (ПГ) приводит к повышению содержания этих гормонов, связанных с белком в сыворотке крови, нарушению эндокринной регуляции беременности и её прерыванию [23 — 26]. АТ к ПГ обнаружены у женщин с привычным невынашиванием беременности [27-28].
При одновременном анализе АТ к химическим канцерогенам и стероидным гормонам в сыворотке крови беременных женщин [29] выяснилось, что возникновение врождённых пороков развития плода (ВПРП) сопровожда-
лось повышением соотношений уровней АТ к БП и АТ к ЭС и ПГ (АТ-БП/ЭС, АТ-БП/ПГ). Это происходило за счёт незначительного возрастания уровней АТ-БП при выраженном снижении АТ-ЭС и АТ-ПГ. Наиболее значимые различия между женщинами с физиологической беременностью (ФБ) и женщинами с ВПРП имели место при делеционных генотипах GSTT1 и GSTM1 у носительниц аллели С гена CYP1A2*1F.
Цель настоящей работы — исследовать взаимосвязи образования антител к эстра-диолу и прогестерону с антителами к бензо[а] пирену у беременных женщин в норме и при врождённых пороках развития плода.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Описание исследуемых групп
Материалом для исследований послужила сыворотка венозной крови 282 беременных женщин, находящихся во II триместре беременности (13 — 27 недель гестации). По результатам ультразвукового исследования плода у 101 женщины выявлены ВПРП, превалировали пороки сердечно-сосудистой (23,4%), моче-выделительной (20,6%), центральной нервной (18,3%), костно-мышечной систем (15,8%), а так же множественные ВПРП (12%). Средний возраст в данной группе составил 26,4(±4,8) лет. 186 беременных женщин, являющихся условно здоровыми, были отнесены в группу сравнения. Средний возраст — 27,5(±5,2) лет. УЗИ (скрининговое при сроке 10—13 недель и 20 — 24 недели и по клиническим показаниям с 12 по 29 недели) проводилось на базах лечебно-профилактических учреждений: Городской клинической больницы № 1, Городского и Областного перинатальных центров г. Кемерово.
Исследование антител
АТ к БП, ЭС и ПГ определяли методом неконкурентного ИФА в собственной модификации с использованием коньюгатов БП, ЭС и ПГ с бычьим сывороточным альбумином (БСА) [30]. В лунки полистирольных иммунологических планшетов вносили по 100 мкл коньюгата гаптен-БСА в концентрации 2 мкг/мл и инкубировали при температуре 25 °С в течение ночи. Для оценки фонового связывания с белком в отдельные лунки вносили неконьюгированный БСА. Для опреде-
ления IgG-АТ к БП, ЭС и ПГ сыворотку крови разводили 1:100 блокирующим раствором. Связавшиеся АТ выявляли с помощью кроличьих АТ против IgG человека, меченных пероксидазой хрена («Sigma», Германия). Регистрацию адсорбированных на планшете АТ проводили с помощью субстратного буфера, содержащего 3,3' ,5,5' -тетраметилбензидин (ТМБ, США), на фотометре (Пикон, Россия) при длине волны 450 нм.
Уровень AT, специфичных к БП и стероидным гормонам, определяли по формулам:
АТ-БП = (ОБ(БП-БСА) -ОБ(БСА)) / ОБ(БСА),
АТ-X = (ОБ(Х-БСА) - ОБ(БСА)) / ОБ(БСА),
где OD — значение оптической плотности в соответствующих лунках, Х-ЭС или ПГ.
Исследование полиморфных вариантов генов детоксикации
Используемые тест-системы для молеку-лярно-генетического анализа SNP-полимор-физма гена CYPIA2 (—163 A ^ C) и полиморфизмов GST (Ml и T1) были разработаны в ИХБФМ СО РАН (г. Новосибирск).
Исследование полиморфизма CYP1A2* 1F проводили с помощью ПЦР/ПДРФ анализа. Для амплификации фрагментов гена CYP1A2 использовали праймеры, содержащие одну замену основания для создания сайта рестрикции, необходимого для выявления полиморфного варианта гена: CYP1A2* 1F-U2: 5' <GGTATCAGCAGAAAGCCAGCAC >3' ^YP1A2* 1F-R2: 5'<CTGATGCGTGTTCT GTGCTTG>3'. Амплификацию полиморфизма CYP1A2*1F проводили на программируемом термоциклере фирмы «ДНК-технология» (г. Москва) при следующих условиях: денатурация (95° С, 3 мин.), 38 циклов в режиме 94 °С — 7 с.; 64 °С — 7с.; 72 °С — 20 с., заключительный синтез (72 °С, 2 мин.). Для идентификации аллельных вариантов CYP1A2* 1F ПЦР продукты гидролизовали при 65 °С в течение 16 ч. эндонуклеазой рестрикции Bst2U (BstN I) (СибЭнзим, г. Новосибирск). Полноту гидролиза оценивали по результатам электрофореза в 7% полиакриламидном геле с последующей окраской в растворе бромистого эти-дия. Распределение частот генотипов CYP1A2 (C/C, C/A, A/A) у женщин изучаемых групп статистически не отличалась от случайного (соответствие их ожидаемым частотам при равновесии Харди-Вайнберга) (p > 0,05).
Таблица 1. Особенности взаимосвязей уровней 1дС-антител к эстрадиолу (у) с уровнями 1дС-анти-тел к бензо[а]пирену(х) у женщин с физиологической беременностью (ФБ) и с врождёнными пороками развития плода (ВПРП) при определённых полиморфных вариантах генов СУР1Л2* 1Р,
СБТИ и аБГМ1
генотип ФБ ВПРП
r y=a*x+b r y=a*x+b
1. без учета генотипа 0,76 y=0,94x+0,39 0,74 y=0,38x + 0,83
2. Л/А CYP1A2*1F 0,71 y=1,0x+0,28 0,8 y=0,39x + 0,82
A/C+C/C CYP1A2*1F 3. GSTT1 «+» 0,77 0,79 y=0,95x+0,35 y=1,11x+0,15 0,6 0,79 y=0,57x + 0,43 y=0,38x + 0,76
GSTT1 «0/0» 4. GSTM1 «+» 0,89 0,76 y=0,86x+0,38 y=0,89x+0,35 0,9 0,91 y=0,37x + 0,97 y=0,52x + 0,47
GSTM1 «0/0» 0,79 y=0,96x+0,4 0,64 y=0,25x+1,13
Примечание: r — коэффициент корреляции по Спирмену.
Таблица 2. Особенности взаимосвязей уровней 1дС-антител к прогестерону (у) с уровнями 1дС-антител к бензо[а]пирену(х) у женщин с физиологической беременностью (ФБ) и с врождёнными пороками развития плода (ВПРП) при определённых полиморфных вариантах генов СУР1Л2* 1Р,
СБТТ1 и СБТМ1.
генотип ФБ ВПРП
r y= a*x+b r y=a*x+b
1. без учета генотипа 0,71 y=0,39x+0,44 0,75 y=0,25x+0,52
2. A/A CYP1A2*1F 0,69 y=0,31x+0,59 0,78 y=0,25x+0,51
A/C+C/C CYP1A2*1F 3. GSTT1 «+» 0,69 0,58 y=0,47x+0,29 y=0,45x+0,39 0,59 0,82 y=0,25x+0,85 y=0,22x+0,48
GSTT1 «0/0» 4. GSTM1 «+» 0,84 0,53 y=0,37x+0,34 y=0,26x+0,63 0,48 0,84 y=0,29x+0,64 y=0,29x+0,3
GSTM1 «0/0» 0,74 y=0,45x+0,38 0,68 y=0,21x+0,7
Примечание: r — коэффициент корреляции по Спирмену.
Типирование полиморфных вариантов генов С5ТМ1 и С5ТТ1 проводили мультиплексной КеаШше ПЦР, как описано ранее [31] . Гетерозиготы по мутации (генотип « + /0») рассматривались в одной группе с носителями нормальных генов (« + »). Отсутствие функциональной активности ферментов II фазы детоксикации С5ТМ1 и С5ТТ1 является следствием обширной делеции в соответствующем гене [32].
Статистическая обработка данных
Статистическую обработку данных, в том числе корреляционный и регрессионный анализ, проводили при помощи пакета прикладных программ 8ТАТКТ1СА 6,0. С использованием критерия Шапиро-Уилка был выявлен ненормальный характер распределения выборки и в дальнейшем оценку статистической значимости различий между
группами проводили при помощи непараметрического и-критерия Манна-Уитни и критерия х2 с поправкой Йетса для непрерывной вариации.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Взаимосвязи между уровнями антител к бензо[а]пирену, эстрадиолу и прогестерону у беременных женщин в норме и при врождённых пороках развития плода
У женщин обеих сравниваемых групп выявлены прямые линейные взаимосвязи между уровнями АТ к БП, с одной стороны, и АТ к ЭС и к ПГ, с другой стороны. Указанные взаимосвязи описываются уравнениями регрессии общего вида у = а^х+Ь, где х-значение уровней АТ-БП; у-значение уровней АТ-ЭС (табл. 1) и АТ-ПГ (табл. 2
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.