научная статья по теме Y-BOX-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК 1 (YB-1) СПОСОБСТВУЕТ ДЕТЕКЦИИ ОБЪЕМНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК ФАКТОРОМ XPC-HR23B Химия

Текст научной статьи на тему «Y-BOX-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК 1 (YB-1) СПОСОБСТВУЕТ ДЕТЕКЦИИ ОБЪЕМНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК ФАКТОРОМ XPC-HR23B»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 2, с. 269 - 279

УДК 577.21

Y-BOX-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК 1 да-1) СПОСОБСТВУЕТ ДЕТЕКЦИИ ОБЪЕМНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК ФАКТОРОМ XPC-HR23B*

© 2015 Е.Э. Фомина1, П.Е. Пестряков1, Е.А. Мальцева1, И.О. Петрусева1, Д.А. Кретов2, Л.П. Овчинников2, О.И. Лаврик13 4**

1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск; электронная почта: lavrik@niboch.nsc.ru 2 Институт белка РАН, 142290 Пущино, Московская область

3 Новосибирский государственный университет, 630090 Новосибирск

4 Алтайский государственный университет, 656049 Барнаул

Поступила в редакцию 27.08.14 После доработки 10.10.14

Система эксцизионной репарации нуклеотидов (ЭРН) является одним из основных механизмов защиты ДНК клетки от повреждений, вызванных такими значимыми экологическими факторами, как ультрафиолетовое облучение, воздействие полициклических ароматических углеводородов, а также лекарственным воздействием противоопухолевых лекарств, например, препаратов цисплатины. Одним из основных компонентов ЭРН является фактор ХРС-НЯ23В, выполняющий ключевую роль на этапе узнавания повреждения ДНК. Связывание ХРС-НЯ23В с ДНК, содержащей разнообразные объемные повреждения, вызывающие нарушения структуры ДНК, являются основой широкой субстратной специфичности рассматриваемой системы репарации. К числу других белковых факторов, обладающих высоким сродством к поврежденной ДНК следует отнести мультифункциональный белок УВ-1. Участие УВ-1 в системе клеточного ответа на генотоксический стресс, его способность к взаимодействию с самым широким спектром поврежденных ДНК, вызывают интерес к его возможному участию и модулированию активности системы ЭРН на стадии узнавания и верификации повреждений. В данной работе были проанализированы функциональные взаимодействия белковых факторов ХРС-НЯ23В и УВ-1 при связывании с ДНК структурами, моделирующими ДНК, содержащую одиночные объемные повреждения, субстраты ЭРН, а также объемные повреждения в комбинации с апуриновыми/апиримидиновыми сайтами, совместно имитирующими кластерное повреждение. Полученные данные показывают, что белки УВ-1 и ХРС-НЯ23В способны стимулировать взаимную посадку на ДНК, содержащую объемное или кластерное повреждение, что свидетельствует о вероятном участии УВ-1 в регуляции репарации повреждений ДНК системой ЭРН.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: эксцизионная репарация нуклеотидов, объемные повреждения ДНК, кластерные повреждения ДНК, ДНК-белковые комплексы, У-Ьох-связывающий белок 1 (УВ-1), ХРС-НЯ23В.

ДНК живой клетки человека постоянно подвергается воздействию экзогенных и эндогенных факторов, вызывающих ее повреждения. К числу основных систем, препятствующих возникновению мутаций посредством эффектив-

ного исправления повреждений, в первую очередь следует отнести эксцизионную репарацию оснований (ЭРО) и эксцизионную репарацию нуклеотидов (ЭРН) [1, 2]. Главная задача ЭРО — исправление повреждений, возникающих в ходе

Принятые сокращения: ЭРН — эксцизионная репарация нуклеотидов; ЭРО — эксцизионная репарация оснований; АП-сайт — апуриновый/апиримидиновый сайт; YB-1 — Y-box-связывающий белок 1; XPC — белковый фактор компле-ментационной группы С пигментной ксеродермы; HR23B — белок человека, гомологичный дрожжевому фактору репарации Rad23.

* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 14-239, 25.01.2015.

** Адресат для корреспонденции.

окислительно-восстановительных реакций, затрагивающих гетероциклические основания молекулы ДНК, таких как спонтанная депуриниза-ция, алкилирование, окисление или восстановление гетероциклических оснований. Субстратами второй системы — ЭРН, в первую очередь являются объемные повреждения, возникающие под действием химических канцерогенов, ультрафиолетового света, и даже некоторых лекарственных препаратов. Интересная особенность системы ЭРН — ее широчайшая субстратная специфичность, заключающаяся в способности исправлять повреждения самой разнообразной химической природы. Такое свойство связано с принципом детекции повреждений, ключевым фактором которой является белковый комплекс ХРС-ИЯ23В, совместно с дополнительными белковыми факторами ХРА, ЯРА распознающий локальное нарушение двойной спирали ДНК вблизи повреждения [3, 4]. Подтверждением того, что ХРС-ИЯ23В является основным компонентом сенсорно-верификационного ансамбля ЭРН, инициирующим сборку предрасщепляющего комплекса, служат эксперименты на клетках фибробластов человека [4]. Несмотря на ключевую роль ХРС-ИЯ23В в системе ЭРН, ранее было показано, что он также физически взаимодействует с повреждениями ДНК, исправляемыми системой эксцизионной репарации оснований (ЭРО), к числу которых в первую очередь следует отнести апуриновые/апи-римидиновые (АП-) сайты [5]. Такие наблюдения могут служить основанием для зачисления фактора ХРС-ИЯ23В в список белков, опосредующих взаимодействие сенсорных компонентов ЭРН и ЭРО. Другим белком, участвующим в непосредственном взамодействии с поврежденной ДНК, является мультифункциональный У-Ъох-связывающий белок УВ-1 [6]. В нормальных условиях УВ-1 локализован преимущественно в цитоплазме клетки, однако в условиях геноток-сического стресса, вызванного самыми разнообразными факторами, например, УФ-облуче-нием, обработкой митомицином С или циспла-тином, большие количества УВ-1 переходят в ядро [7—9]. Кроме того, УВ-1 обладает повышенным сродством к поврежденной ДНК, содержащей АП-сайты или другие нарушения структуры, связывает одноцепочечную форму ДНК предпочтительнее, чем двухцепочечную [10—12]. Наконец, известно, что УВ-1 физически и функционально взаимодействует с ключевыми белками и ферментами ЭРО, такими как АРЕ1, ДНК-полимераза в, ДНК-гликозилазы ОТШ2 и ШШ [7, 13-16]. Особенности внутриклеточной локализации и сеть функциональных взаимодействий позволяет рассматривать

УВ-1 в качестве модулирующего компонента ре-паративных комплексов, обеспечивающего функциональную связь системы ЭРО с другими путями восстановления целостности ДНК. Имеющиеся данные литературы свидетельствуют, что УВ-1 участвует в процессе репарации объемных повреждений ДНК, таких как цикло-бутан-пиримидиновые димеры, цис-платино-вые аддукты и продукты взаимодействия ДНК с митомицином С [8, 17]. Подобная широкая специфичность как УВ-1, так и ХРС-ИЯ23В по отношению к спектру повреждений ДНК позволяет рассматривать белки в качестве участников репарации кластерных повреждений ДНК, состоящих из индивидуальных повреждений различной природы и структуры. В данной работе мы проанализировали возможность взаимодействия УВ-1 и ХРС-ИЯ23В с ДНК-структурами, содержащими одновременно такие повреждения, как АП-сайт и остаток флуоресцеина, модулирующий объемное повреждение ДНК.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Белки и олигонуклеотиды. Рекомбинантные YB-1 и XPC-HR23B были выделены и очищены согласно опубликованным протоколам [18, 19]. Рекомбинантные APE1 и урацил-ДНК-глико-зилаза E. coli (Ung) были любезно предоставлены С.Н. Ходыревой (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск). В работе использована полинук-леотидкиназа фага Т4 производства «Биосан» (Россия). Последовательности использованных в работе олигонуклеотидов ODN1, ODN2 («Био-сет», Россия) и ODN3 (любезно предоставленные В.Н. Сильниковым, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН) представлены в табл. 1.

Для экспериментов, проведенных методом «задержки в геле», с целью визуализации ДНК цепь ODN1 была 5'-радиоактивно мечена с использованием полинуклеотидкиназы фага Т4 и [y-32P]ATP (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН). Непро-реагировавший [y-32P]ATP удаляли из смеси путем гель-фильтрации на колонке MicroSpin G-25 («GE Healthcare Life Sciences», Швеция) согласно протоколу производителя. Для получения дуплексов олигонуклеотид ODN1 гибриди-зовали с комплементарной цепью ODN2 либо ODN3 в молярном соотношении 1 : 1,2. АП-сай-ты в ДНК-субстратах получали in situ непосредственно перед реакцией, инкубируя урацил-со-держащие ДНК-субстраты с Ung (0,15 ед/пмоль ДНК) в течение 20 мин при 37° (условные обоз-

начения полученных дуплексов, а также их схематические изображения представлены в табл. 2).

В экспериментах по флуоресцентному титрованию в качестве репортерной группировки использовался остаток флуоресцеина в составе ДНК-структур (Bulk, АР-Ви1к) (длины волн возбуждения и эмиссии флуорофора — 495 и 520 нм соответственно). Измерение анизотропии и интенсивности флуоресценции проводили в планшетах на приборе POLARstar Optima («BMG Labtech», Германия), значения величин, полученные для каждой реакционной смеси на одном шаге сканирования, соответствовало вычисленному среднему значению из 50 измерений прибора. Для повышения достоверности значений применяли режим кинетического сканирования, при котором весь планшет с серией реакционных проб сканировали 10 раз, а потом полученные значения усредняли для каждой экспериментальной пробы в серии.

Определение доли активного белка в препаратах УБ-1 и XPC-HR23B. Термином «активный белок» здесь и далее обозначается белок, способный связывать ДНК, а «суммарная концентрация белка» соответствует концентрации белка в препарате, определенной колориметрически по методу Брэдфорда. Для определения концентрации активного белка в препаратах УВ-1 и ХРС-НЯ23В было проведено титрование ДНК препаратом анализируемого белка в условиях стехиометрического связывания (предполагаемая концентрация активного белка и концентрация ДНК были не менее чем на порядок выше предполагаемой константы диссоциации комплекса белок-ДНК) согласно методике, описанной в [20]. В случае УВ-1 реакционные смеси (150 мкл) содержали стандартные буферные компоненты (буфер ЯВ — 50 мМ Тш-НО, 100 мМ №С1, 5 мМ МяС12, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0,6 г/л БСА), анализируемый белок в варьируемой суммарной концентрации и флуорес-

Таблица 1. Обозначения и последовательности олигонуклеотидов

ODN1 5'- CTATGGCGAGGCGATTAAGTTGGG UAACGTCAGGGTCTTCCGAACGAC-3'

ODN2 ODN3 5'-5' GTCGTTCGGAAGACCCTGACGTTGCCCAACTTAATCGCCTCGCCATAG-3' -GTCGTTCGGAAG

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»