БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 2, с. 122-127
УДК 591.145.2; 591.145.3
ЯДЫ ЗМЕЙ СЕМЕЙСТВА Viperidae СПОСОБНЫ БЛОКИРОВАТЬ НИКОТИНОВЫЕ ХОЛИНОРЕЦЕПТОРЫ И ПОТЕНЦИАЛ-АКТИВИРУЕМЫЕ Са2+-КАНАЛЫ ИДЕНТИФИЦИРОВАННЫХ НЕЙРОНОВ ПРУДОВИКА Lymnaea stagnalis
© 2008 г. Е. В. Горбачева, В. Г. Старков*, В. И. Цетлин*, Ю. Н. Уткин*, Е. Ä. Вульфиус
Институт биофизики клетки РАН, г. Пущино Московской обл., 142290, ул. Институтская, 3;
тел. (4967)73-93-47; факс (4967)33-05-09; электронная почта: lena_gorbacheva@mail.ru; *Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва 117997
Поступила в редакцию 28.08.2007 г.
Яды змей содержат соединения, действующие на различные клеточные мишени. Так, в ядах змей семейства Elapidae содержатся хорошо известные а-нейротоксины, имеющие высокое сродство к никотиновым холинорецепторам (нХР), и немногочисленная группа токсинов, блокирующих Са2+-и К+-каналы. О наличии антагонистов нХР и блокаторов потенциал-активируемых Са2+-каналов в ядах змей семейства Viperidae известно очень мало. Мы испытали действие яда шести видов змей этого семейства и яда кобры Naja kaouthia (сем. Elapidae) на нХР и потенциал-активируемые Са2+-каналы нейронов прудовика Lymnaea stagnalis. Исследования проводили на изолированных идентифицированных нейронах L. stagnalis в условиях фиксации потенциала. Установлено, что яды змей семейства Viperidae обладают способностью блокировать нХР и потенциал-активируемые Са2+-ка-налы. Эффективность блокирования нХР существенно ниже, чем у яда кобры N. kaouthia, имеющего высокое содержание а-нейротоксинов (классических блокаторов нХР), но блокирование Са2+-каналов ядами Viperidae и кобры сходно. Полученные данные позволяют предположить, что исследованные яды Viperidae содержат токсины - блокаторы мишеней обоих типов.
Известно, что яды змей представляют собой многокомпонентные смеси соединений в основном полипептидной природы. По своему биологическому действию все яды можно условно разделить на два типа: нейротоксические, которые поражают преимущественно нервную систему, и гемоток-сические, эффекты которых заключаются в нарушении, главным образом, функционирования систем крови. К первому типу относятся яды змей семейства Е1ар1йае, обладающие наибольшей токсичностью. Второй тип включает яды змей семейства У1рвг1йав. Вместе с тем известно, что нейротоксические яды могут содержать гемотоксические соединения и, наоборот, в состав гемотоксических ядов могут входить нейротоксины.
Мишенями нейротоксинов являются различные рецепторы, ионные каналы и другие мембранные белки. Большинство нейротоксинов обладает не только высоким сродством, но и высокой избирательностью к определенной мишени и благодаря этому используется для идентификации и исследования структурных и функциональных характеристик мембранных белков. Лучше всего изучены а-нейротоксины, содержащиеся в яде крайтов и кобр (семейство Е1ар1йав), которые блокируют никотиновые холинорецепторы (нХР) мышечного типа и а7-гомомерный нейронный нХР [1-3]. Ме-
нее изучено действие компонентов яда змей на потенциал-активируемые ионные каналы. Тем не менее, найдены полипептиды, высокоактивные в отношении потенциал-управляемых Са2+- и К+-ка-налов. Так, из яда черной мамбы Dendroaspis polyl-epis polylepis выделены полипептиды кальцисеп-тин и FS2, избирательно блокирующие Са2+-кана-лы L-типа в кардиомиоцитах, гладкомышечных клетках, нейронах и клетках нейробластомы линии NG 105-15 [4-6]. Однако не все полипептиды, ранее считавшиеся специфическими блокаторами высокопороговых Са2+-каналов, оказались избирательными. Так, тайкатоксин из Oxyuranus scutellatus в одних и тех же концентрациях блокирует в хромаффинных клетках крысы не только Са2+-ток, но и Са2+-активируемый К+-ток через каналы низкой проводимости ^К(Са)-каналы) [7]. Недавно показали, что натрин - белок семейства CRISP из яда кобры Naja atra - это высокоактивный бло-катор Са2+-активируемых К+-каналов высокой проводимости (ВК(Са)) в клетках аорты мыши [8]. Избирательных блокаторов других типов Са2+- и К+-каналов среди токсинов яда змей пока не найдено.
Сведения о структуре и активности полипептидов из яда змей семейства Viperidae, взаимодействующих с нейрорецепторами и ионными канала-
ми, крайне скудны. Так, ток через Са2+-каналы Ь-типа в клетках желудочка сердца морской свинки потенцируется атротоксином - полипептидом из яда гремучей змеи [9]. Действие абломина из яда японского щитомордника Agkistrodon Ыomhoffi на вызванное калиевой деполяризацией сокращение гладкой мышцы сходно с эффектом кальцисепти-на и поэтому, как предполагается, обусловлено блоком Са2+-каналов Ь-типа [10]. Единственным примером выделенных из яда змей семейства Vi-peridae соединений, действующих на нХР, являются полипептидные токсины ваглерины [11]. Эти токсины выделены из яда храмовой куфии Trime-resurus wagleri.
Поиск в ядах змей семейства Viperidae компонентов, активных в отношении различных типов рецепторов и ионных каналов, представляется перспективным, так как в результате могут быть получены соединения с новыми фармакологическими свойствами.
В нейронах прудовика Lymnaea stagnalis экс-прессируются нХР и потенциал-управляемые ионные каналы (кальциевые, калиевые, натриевые). Очень дешевые по сравнению с нервными клетками млекопитающих нейроны прудовика могут использоваться как модель для исследования избирательных нейроактивных соединений. Ранее нами было показано, что пять идентифицированных нейронов в париетальных ганглиях прудовика имеют рецепторы, сходные по относительной чувствительности к агонистам и антагонистам с гомомер-ным а7-содержащим нХР позвоночных [12, 13]. В отличие от всех известных нХР позвоночных эти рецепторы управляют хлорной проводимостью [14, 15]. Недавно голландские исследователи клонировали кДНК 12 субъединиц нХР нейронов прудовика и предсказали анионную избирательность четырех из них [16, 17]. При экспрессии в ооцитах Xenopus получен функциональный гомопентамерный нХР с хлорной проводимостью, весьма сходный по фармакологическому профилю как с нативными нХР париетальных нейронов прудовика, так и с а7-нХР позвоночных [16]. С другой стороны, известно, что потенциал действия в гигантских нейронах моллюсков генерируется главным образом за счет тока через потенциал-управляемые Са2+-каналы. Входящий Са2+-ток характеризуется относительно низким порогом активации, заметной инактивацией во времени и очень низкой чувствительностью к дигидропиридинам (Н.К. Чемерис, неопубликованные данные; Е.В. Горбачева и Е.А. Вульфиус, неопубликованные данные). В последние годы в нейронах L. stagnalis обнаружена функциональная экспрессия канальных белков с довольно высокой степенью гомологии а1-субъединиц, определяющих основные биофизические и фармакологические свойства, с а1-субъединицами Ь-, К-, Р/0- и Т-типов Са2+-каналов млекопитающих [18]. По всей видимости, Са2+-ток в нейронах прудовика являет-
ся суммарным током через каналы нескольких типов, и эти клетки могут быть использованы для тестирования предполагаемых избирательных антагонистов.
Мы исследовали способность цельных ядов шести видов змей семейства Viperidae блокировать нХР и потенциал-управляемые Са2+-каналы в нейронах L. stagnalis. Поскольку яд кобры N. kaouthia содержит хорошо охарактеризованные нейроток-сины, действующие на нХР L.stagnalis, в качестве контроля мы исследовали цельный яд N. kaouthia. Мы также проверили способность этого яда блокировать потенциал-активируемые Са2+-каналы. В результате было установлено, что яды змей семейства Viperidae обладают способностью блокировать нХР и потенциал-активируемые Са2+-кана-лы. Обнаружено также, что яд кобры может блокировать потенциал-управляемые Са2+-каналы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали Trizma-HCl, EGTA и HEPES производства фирмы "Sigma" (США), аце-тилхолин йодид (АХ) фирмы "Serva" (Германия).
Работа проведена на идентифицированных нейронах L. stagnalis, изолированных из большого и малого париетальных ганглиев (Бп 1,2; Мп 1-3), в условиях фиксации мембранного потенциала и внутриклеточной перфузии. Нейроны изолировали механически после мягкой ферментативной обработки по методике, описанной в [19]. Все эксперименты проводили при температуре 20-23 °С в осенне-зимний период.
Опыты проводили при постоянном протекании через экспериментальную камеру раствора следующего состава: 88 мМ NaCl, 1.6 мМ kCi, 4 мМ BaCl2, 1.5 мМ MgCl2, 4 мМ Trizma-HCl, рН 7.6. Хорошо проникающие через Са2+- каналы ионы Ba2+ использованы вместо Ca2+ во избежание возможного влияния Ca2+-активируемой фосфолипазы A2, которая содержится в ядах змей, или других Са2+-зависимых компонентов яда на мембрану клеток. Состав внутриклеточного раствора: 95 мМ CsCl, 0.3 мМ СаС12, 2 мМ EGTA, 10 мМ HEPES, рН 7.2.
АХ апплицировали на всю поверхность клетки импульсами длительностью 4 с и с интервалами между импульсами не менее 6 мин. Ток через Ca2+-каналы возбуждали скачком потенциала длительностью 200 мс от поддерживаемого уровня (-6070 мВ) в сторону деполяризации. Опыты проводили с помощью метода внутриклеточной перфузии, по конфигурации сходного с "whole-ceU''-вариан-том метода пэтч-кламп: потенциал на всю внутреннюю поверхность мембраны задается через пипетку и отверстие в мембране под пипеткой, ток отводится электродом в камере. Отличие от классической "whole-cell" конфигурации состоит в диаметре отверстия в мембране (оно в 10 раз больше)
Кобра
Naja kaouthia
AX 5 мкМ
-20 мВ -60 мВ"
0.5 мг/мл
Контроль
Степная гадюка Африканская гадюка
Vipera renardi AX 5 мкМ
0.5 мг/мл 0.5 мг/мл
Контроль
-20 мВ -60 мВ"
2 мг/мл
Контроль
Bitis arietans AX 2 мкМ
0 мВ
-60 мВ'
Гюрза Vipera lebetina
AX 5мкМ
2 с
-20 мВ -60 мВ"
2 мг/мл
А н
О
0.1 с
а
Рис. 1. Действие цельных ядов кобры, степной гадюки, африканской гадюки и гюрзы на ответы нейронов на АХ или скачок потенциала. а - Ответы четырех нейронов на АХ в концентрациях, соответствующих ЕС50 для каждой клетки. • - Ва2+-ток через потенцал-активируемые Са2+ -каналы в четырех других нейронах в ответ на деполяризующий скачок д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.