МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 78, № 5, с. 716-718
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 582.21.05
YARROWIA ЫРОЬУЛСА - ПРОДУЦЕНТ ^ЛАКТАТОКСИДАЗЫ
© 2009 г. Е. Н. Бирюкова1, Я. О. Ступарь, А. Ю. Аринбасарова, А. Г. Меденцев
Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Поступила в редакцию 27.10.2008 г.
L-Лактатоксидаза (КФ 1.1.3.X) - флавиновый фермент, катализирующий окисление лактата до пирувата с восстановлением кислорода до перекиси водорода. Фермент широко используется в медицине для определения содержания лактата в крови человека при различных патологических состояниях, сопровождающихся неадекватным поступлением кислорода в ткани (острые кровотечения, тяжелая сердечная недостаточность, заболевания сердца с цианозом, острая гипоксия, сосудистый коллапс и др.). На основе лактатокси-дазы созданы биосенсоры, используемые в медицине, виноделии и производстве продуктов питания [1]. Среди микроорганизмов фермент обнаружен у бактерий Aerococcus viridans [2], Streptococcus faecalis [3], Pediococcus sp. [4, 5], Lac-tococcus lactis [6] и грибов Geotrichum candidum [1, 7]. О синтезе лататоксидазы дрожжами в литературе данных нет. Ранее [8, 9] нами были исследованы различные аспекты адаптации дрожжей Yarrowia lipolytica к стрессовым воздействиям (оксиданты, повышенная температура и др.). Показано, что у Y. lipolytica в стрессовых состояниях происходит снижение уровня внутриклеточного цАМФ, увеличение активностей антиоксидант-ных ферментов (каталазы, супероксиддисмутазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глутатионре-дуктазы), а также появление альтернативной, ци-анидрезистентной оксидазы [8-10]. Цель настоящего исследования - показать способность дрожжей Y. lipolytica к синтезу L-лактатоксидазы в стандартных условиях роста и при стрессовых воздействиях.
В работе изучались дрожжи Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2378 (syn. Yarrowia lipolytica Y-155), полученные из ВКМ ИБФМ РАН. Культивирование осуществляли при 29°С в колбах объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды Ридер [8] с глюкозой (1%) или L-лактатом (1%), на качалке (200 об/мин). Рост дрожжей оценивали по оптической плотности клеточной суспензии (к = 540 нм).
Клетки из экспоненциальной (8 ч) или стационарной (14 ч) фаз роста, выращенные на среде с глюкозой, дважды промывали стерильной дистил-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: biryukovae05@ram-bler.ru).
лированной водой и ресуспензировали в 50 мМ трис-фосфатном буфере, рН 7.2 ( клетки без обработки). Для адаптации клеток к мягким стрессовым воздействиям их инкубировали в присутствии 0.5 мМ Н202 (60 мин) или при температуре 37°С (60 мин) [8, 9].
Для изучения распределения активности фермента по фракциям клетки, выращенные на среде с лактатом, дважды промывали дистиллированной водой и суспендировали в 50 мМ трис-фосфатном буфере (рН 7.0), содержащем 0.5 мМ фенилметил-сульфонилфторид (ингибитор протеаз) [8]. Суспензию клеток (1 мг сухих клеток/мл) разрушали на прессе Френча, гомогенат центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин, осадок отбрасывали, а су-пернатант центрифугировали при 105000 g 60 мин.
Лактатоксидазную активность растворимой и мембранной фракций, а также гомогената и целых клеток определяли по скорости потребления кислорода на полярографе с помощью закрытого тефло-новой пленкой платинового электрода типа Кларка [10] в присутствии 5 мМ ¿-лактата и выражали в нмоль 02 мин-1 мг-1сухих клеток или нмоль 02 мин-1 мг-1 белка.
Активность фермента в растворимой фракции также регистрировали на спектрофотометре "8Ы-та^и" по скорости образования перекиси водорода в 20 мМ трис-фосфатном буфере (рН 8.0) в присутствии о-дианизидина (0.2 мМ), пероксидазы (5 мкг/мл) и ¿-лактата (2 мМ), (Е436 = 8.3 мМ-1 см-1) [7]. За единицу активности (Е), принимали количество фермента, катализирующего окисление 1 мкмоля ¿-лактата в 1 мин.
Каталазную активность оценивали по изменению поглощения Н202, Е240 = 0.32 мМ-1 см-1 [8].
Было обнаружено, что после адаптации к различным стрессовым воздействиям (инкубации клеток в присутствии малых доз оксиданта или при 37°С) у клеток У. ИроЬуйеа из экспоненциальной фазы роста появлялась способность окислять ¿-лактат (рис. 1, кривые 2 и 3). Неадаптированные клетки (без обработки) ¿-лактат не окисляли (кривая 1). Переход дрожжей в стационарную фазу роста, обусловленный исчерпанием глюкозы, также приводил к появлению способности клеток окислять этот субстрат (кривая 4). Таким образом, стрессовые воздей-
YARROWIA LIPOLYTICA - ПРОДУЦЕНТ L-ЛАКТАТОКСИДАЗЫ
717
Клетки (экспоненц.)
I ' 80
Клетки (Н2О2)
Лактат
80
100 нмоль O2
1 Клетки (37°)
1 мин
Лактат
3'
45
Лактат
35 I
70
Клетки (стац.)
Лактат 35 J,
60
50
Клетки (лактат)
Лактат 25 \
Р. фракция
Лактат
45
145
Рис. 1. Окисление ¿-лактата клетками У. Иро1уйса из экспоненциальной (1, 2, 3, 5, 6) и стационарной (4) фаз роста. 1—4 — клетки, выращенные на глюкозе: 1, 4 - без обработки; 2 - 0.5 мМ Н2О2 , 60 мин; 3 - 37°С, 60 мин; 5, 6 - клетки, выращенные на ¿-лактате: 5 - клетки; 6 - растворимая фракция. Активность лактатоксидазы указана цифрами на кривых: 1—5 — нмоль О2 мин-1 мг-1 сухих клеток, 6 - нмоль О2 мин-1 мг-1 белка.
8 g
s * ма ол
Н I р ^
14
12 10 i
„ 8 -акта 6
4
2
0 10 20
Время культивирования, ч
Рис. 2. Синтез ¿-лактатоксидазы в процессе роста У. Иро1уйса на ¿-лактате. 1 - накопление биомассы, 2 - концентрация Ь-лактата, 3 - активность ¿-лактатоксидазы.
ствия приводят не только к увеличению активности антиоксидантных ферментов (каталазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, супероксиддисмутазы, глу-татионредуктазы), как это было показано ранее [8, 9], но и к появлению активности лактатоксидазы.
Следовало ожидать, что активность лактатоксидазы в клетках может быть более высокой при выращивании их на среде с лактатом. Действительно, клетки, выращенные в присутствии лактата, показа-
ли более высокую скорость его окисления (рис. 1, кривая 5).
На рис. 2 представлены данные накопления биомассы и активности лактатоксидазы в процессе роста У. Иро1уг1са на среде с лактатом. Видно, что активность лактатоксидазы (кривая 3) коррелирует с увеличением биомассы дрожжей (кривая 1). При переходе клеток в стационарную фазу роста (12-14 ч), обусловленном исчерпанием лактата (кривая 2), синтез фермента прекращался.
2
4
3
6
5
МИКРОБИОЛОГИЯ том 78 < 5 2009
718
БИРЮКОВА и др.
Распределение активности L-лактатоксидазы по фракциям Y. lipolytica
Общая Содержание
Фракция активность, Е/мл лактатоксидазы, %
Гомогенат 40.0 100
(1 мг сухих кл./мл)
Мембранная фракция 1.5 4
Растворимая фракция 38.5 95
Определение локализации лактатоксидазы в клетке показало, что фермент, в основном, находится в растворимой фракции клеток (таблица). Наличие некоторого уровня активности в мембранной фракции обусловлено, вероятно, частичной сорбцией фермента на мембранах. Необходимо отметить, что клетки, выращенные на среде с лактатом, отличались более высокой активностью каталазы (148 ± 2.5 мкмоль мин-1 мг-1 белка) по сравнению с клетками, выращенными на глюкозе (28.0 ± ± 1.3 мкмоль мин-1 мг-1 белка) [8, 9].
Таким образом, впервые показана способность дрожжей к синтезу лактатоксидазы. Установлено, что синтез этого фермента у У. ИроЬуйса происходит в ответ на стрессовые воздействия, а также при росте на лактате в качестве единственного источника углерода и энергии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Sztajer H, Wang W, Lundsford H, Stocker A. Purification and some properties of a novel microbial lactate oxidase // Appl. Micobiol. Biotechnol. 1996. V. 45. P. 600-606
2. Duncan J.D., Wallis JO, Azari MR. Purificaion and properties of Aerococcus viridans lactate oxidase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. V. 164. P. 919-926.
3. Esders T.W., Goodhue C.T., Schubert R.M. Analysis of lactic acid or lactate using lactate oxidase // US Patent. 1979. V. 4. P. 166-173.
4. Tzaneakis N, Litopoulou-Tzanetaki E. Biochemical activities of Pediococcus pentosaceus isolated of dairy origin // J. Dairy Sci. 1989. V. 72. P. 859-863.
5. Mizutani F, Sasaki K, Shimura Y. Sequential determination of L-lactate and lactate dehydrogenase with immobilized enzyme electrode // Anal. Chem. 1983. V. 55. P. 35-38.
6. Atsusi T, Yoshiaki N. Gene cloning, purification, and characterization of lactate oxidase from Lactococcus lactis subsp. cremoris IFO3427 // J. Ferment. Bioeng. 1998. V. 85. P. 507-510.
7. Куплетская М.Б., Сухачева M.B., Кураков А.В., Нетрусов А.И. Поиск микроорганизмов-продуцентов лактатоксидазы // Прикл. биохимия и микробиология. 2007. Т. 4. № 2. С. 199-202.
8. Бирюкова Е.Н., Меденцев А.Г., Аринбасаро-ва А.Ю., Акименко В.К. Устойчивость дрожжей Yarrowia lipolytica к окислительному стрессу // Микробиология. 2006. V. 75. № 3. P. 293-298.
9. Бирюкова Е.Н, Меденцев А.Г, Аринбасарова А.Ю, Акименко В.К. Адаптация дрожжей Yarrowia lipolytica к тепловому стрессу // Микробиология. 2007. V. 75. № 2. P. 184-190.
10. Бирюкова Е.Н, Меденцев А.Г, Аринбасарова А.Ю, Акименко В.К. Дыхательная активность дрожжей Yarrowia lipolytica в условиях окислительного и теплового стрессов // Микробиология. 2008. Т. 77. № 4. С. 448-452.
МИКРОБИОЛОГИЯ том 78 < 5 2009
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.