ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 2, с. 98-104
БИОХИМИЯ РАЗВИТИЯ
УДК 582.475.4:581.3:577.122
ЗАКОНОМЕРНОСТИ БИОСИНТЕЗА БЕЛКОВ ЗАРОДЫША И ЭНДОСПЕРМА В ПРОЦЕССЕ ЭМБРИОГЕНЕЗА У Pinus sylvestris L.1
© 2004 г. О. А. Новожилова, М. Н. Гринаш*, Л. П. Арефьева, В. Ф. Семихов
Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН 127276 Москва, ул. Ботаническая, д. 4 *Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия 603107 Нижний Новгород, пр-т Гагарина, д. 97 Поступила в редакцию 17.12.02 г. Окончательный вариант получен 22.05.03 г.
Закономерности биосинтеза белков зародыша и эндосперма в процессе эмбриогенеза у сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) исследовали посредством электрофореза и иммунохимии. Присутствие белков альбумино-глобулиновой фракции наблюдалось уже на ранних стадиях развития зародыша. Основные полипептидные компоненты (48-60; 37-39; 20-22 кДа) постепенно накапливаются на протяжении созревания. Отмечена высокая степень синхронности между стадиями эмбриогенеза и молекулярными событиями, связанными с биосинтезом и аккумуляцией белков в развивающемся семени.
Ключевые слова: сосна обыкновенная, эмбриогенез, зародыш, эндосперм, белки.
Литература по эмбриологии хвойных многочисленна, а для некоторых видов имеются очень детальные морфологические описания развития семени. Голосеменные принципиально отличаются от покрытосеменных по развитию зародыша (Данович и др., 1982), хотя между физиологией зародышей покрыто- и голосеменных, по-видимому, не существует особенно больших различий (Цингер, 1958). Зародыши голосеменных тоже, как правило, богаты запасными питательными веществами, причем необходимый для начала прорастания набор веществ сосредоточен в зародыше, а вещества, извлекаемые из эндосперма, требуются для дальнейшего развития. Использование биохимических критериев, таких как изменения в белках, позволяет получить ценную информацию об относительном состоянии тканей, наиболее близко отражающую уровень генной экспрессии, только получить эти сведения значительно легче (Roberts et al., 1989). Среди хвойных наиболее подробно белки семян исследованы у представителей родов Picea и Pinus.
Параллельное изучение роста и метаболизма белков является важным этапом в познании процессов, определяющих специфическую диффе-ренцировку и развитие клеток, ответственных за воспроизведение организма. Как было показано на P. sibirica (Ермаков и др., 1981), уже в процессе созревания яйцеклетки идет интенсивное накоп-
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 02-04-48093).
ление РНК и белков в ядре и цитоплазме, что свидетельствует о высокой биохимической активности в период, предшествующий оплодотворению.
Основные запасные белки семени синтезируются и аккумулируются в процессе созревания зародыша. Так, синтез запасных белков в ткани ме-гагаметофита Picea glauca впервые возможно обнаружить в период оплодотворения, что совпадает с инициацией фазы проэмбрио (Misra, Green, 1991), а в диплоидных зародышах - на ранних стадиях, когда физически было возможно отделить зародыш от мегагаметофита. Максимум экспрессии генов запасных белков приходится на период до формирования меристематических участков зародыша, что обнаружено при исследовании Picea abies (Stabel et al., 1990): накопление основной массы запасных белков происходит в процессе позднего эмбриогенеза. Основные запасные белки зрелого семени Picea представлены полипептидами с молекулярной массой 42, 33, 22 и менее 14 кДа (Misra, Green, 1990). В мегагамето-фите преобладают компоненты 22 и 33 кДа, а в зародыше - 42 кДа (Hakman et al., 1990). То, что эти белки являются запасными, подтверждается следующим (Misra, Green, 1990): расходованием в процессе прорастания; богатством кристаллоид-ных белков 42 и 35 кДа глютамином (источник азота для прорастающего проростка); сходством с легуминами и гомологичными белками дву- и однодольных по заряду и субъединичным свойствам, включая дисульфидные мостики и сходную молекулярную гетерогенность (Jensen, Berthold,
Сроки взятия образцов семян P. sylvestris в 1998-2000 гг.
Годы Число и месяц
июнь июль август сентябрь октябрь
1998 17, 23 01, 05, 10, 15, 19, 24 22
1999 07*, 14*, 29 07, 16, 23, 29 05, 12, 19, 27 03, 10, 17, 24 01, 10
2000 09, 17 01, 09, 17, 27 01, 11, 18, 31
Примечание. * Образцы без разделения на зародыш и эндосперм.
1989); универсальностью белков для гаплоидного мегагаметофита и диплоидного зародыша у хвойных и универсальностью ди- и триплоидной тканей семени покрытосеменных.
Известно, что содержание общего белка в зрелом семени представителей рода Pinus колеблется от 10 до 24% (от веса семени), для P. sylvestris -22% (Gifford, Tolley, 1988; Орехова, 1998). На долю нерастворимых белков (кристаллоидов) приходится 58%, а растворимых - 42%. Для P. montícola (в целом семени которой соотношение нерастворимых кристаллоидных и растворимых белков такое же, как у P. sylvestris) установлено, что соотношение этих белков у мегагаметофита зрелого семени составляет 60.5 и 39.5%, а у зародыша - 7.3 и 92.7% соответственно. Основные кристаллоидные белки зрелых семян исследованных видов сосны в невосстановленной форме имеют молекуляр. массу 51-55 кДа, а в восстановленной - 31-34.5 и 21.5-22.5 кДа (Gifford, Tolley, 1988), т.е. относятся к тем же классам белков, что обнаружены и у Picea. Для аминокислотного состава зародыша и эндосперма Pinus pinea характерно очень высокое содержание аргинина (16.8 и 20.1% соответственно) (Семихов и др., 1997), содержание глютаминовой кислоты составляет 20.5 и 21.1%, а пролина - 4.6 и 4.4% соответственно.
Однако понимание биохимических процессов и молекулярных событий, отражающих синтез и накопление белка в процессе эмбриогенеза у представителей рода Pinus, остается недостаточным. Цель работы - исследовать белки семян эндосперма и зародыша P. sylvestris в процессе эмбриогенеза с привлечением материала, собранного в природных условиях в местах естественного произрастания. Подобные исследования, как отмечалось выше, проводились ранее лишь на Picea glauca (Misra, Green, 1991) и только на запасных белках. В наших же исследованиях проведено электрофоретическое исследование полного спектра альбуминов и глобулинов отдельно зародыша и эндосперма, что более точно отражает задачи, поставленные в настоящей работе. Кроме того, помимо метода электрофореза был использован иммунохимический анализ, позволя-
ющий проследить гомологичность белков у развивающегося зародыша и эндосперма.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Сбор материала проводили в естественных насаждениях сосняка разнотравного на базе Клю-чищенского лесничества Нижегородской обл. Шишки были взяты с двух модельных деревьев сосны обыкновенной (P. sylvestris L.) в возрасте 45 лет с диаметром стволов 20 и 26 см и высотой 16 и 20 м соответственно, с верхней и средней частей крон. Образцы собирали в летне-осенний период в течение трех лет вегетации: в 1998 г. было сделано 9 сборов (с 17 июля по 22 сентября); в 1999 г. - 15 (с 7 июня по 10 октября); в 2000 г. - 10 (с 9 июня по 31 августа) (таблица). В качестве контрольных были взяты образцы полностью вызревших семян, собранных в феврале 1996 и 1999 гг., на основании рекомендаций (Наставления..., 1994) и после проведения соответствующих наблюдений в Дальнеконстантиновском лесхозе Нижегородской обл. в 1995 г. Из каждой выборки в 30 шишек брали минимально по 600 семян. Зародыш отделяли от эндосперма и помещали в морозильную камеру при температуре -18°С. Морфологические наблюдения за процессом эмбриогенеза проводили посредством световой микроскопии. Препарирование замороженных семян и определение морфометрических показателей выполняли по стандартной методике (Клейн Р., Клейн Д., 1974). Процесс эмбриогенеза прослеживали по стадиям (Донская, Данович, 19776), учитывая дифференцировку и размер зародыша, суспензора и состояние эндосперма (Гринаш, 2003).
Электрофорез. Электрофоретические исследования белков зародыша и эндосперма сосны обыкновенной проводили на образцах 1998 г. Со-лерастворимые белки извлекали из тонко размолотых образцов путем четырехкратной обработки охлажденных навесок 1М NaCl на 0.1М трис-аскорбатном буфере, рН 7.0 в соотношении 1 : 10. После центрифугирования (10000 g, 10 мин) в су-пернатанте глобулины отделяли от альбуминов
12 3 4
1 2
кДа 94.067.043.0-
зо.о-1 20.1 — 14.4 —
20.1 —
14.4 —
кДа 94.067.043.0-
зо.о-
20.1 — 14.4 —
Рис. 1. Влияние обезжиривания на извлечение глобулинов и альбуминов из семян P. sylvestris без (1, 3) и с обработкой петролейным эфиром (2, 4): а - целое семя (глобулины); б - зародыш (1, 2) и эндосперм (3, 4) (глобулины); в - целое семя (альбумины). Положение белков-маркеров: 94.0 - фосфорилаза b; 67.0 - бычий альбумин; 43.0 - овальбумин; 30.0 - карбоангидраза; 20.1 - ингибитор трипсина; 14.4 - лактальбумин.
Стрелками обозначены полипептидные компоненты, по которым наблюдались наиболее выраженные различия.
путем осаждения при 50%-ном насыщении раствора (КН4)2Б04 при 4-6°С в течение суток. Осадок отделяли центрифугированием (15000 20 мин). Альбумины осаждали из супернатанта путем насыщения до 70%-ного раствора (КН4)2Б04. Осаждение альбуминов и глобулинов осуществляли по классической методике (Келлер, Блок, 1963; Досон и др., 1991). Лиофильно высушенные препараты (1 мг) как альбуминов, так и глобулинов растворяли в 200 мкл буфера (0.125 М трис-НС\, рН 6.8; 4%-ный ДДС натрия; 20%-ный глицерол; 10%-ный 2-меркаптоэтанол), затем кипятили в течение 2 мин и помещали на лед в морозильную камеру при -18°С. Электрофорез проводили в 12.5%-ном полиакриламидном геле в присутствии ДДС натрия в восстановленных условиях по методике Лэммли (ЬаешшИ, 1970).
Иммунохимия. Для иммунохимических исследований использовали образцы семян 1999 г. Кроличью антисыворотку получали на альбумино-глобулиновую фракцию (АГФ) белков, извлеченную путем обработки цельносмолотого семени раствором 1 М КаС1 на 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.0, по принятой для растительных белков методике (Гаврилюк и др., 1973). В качестве белков-антигенов использовали белки, извлеченные в ре-
зу
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.