научная статья по теме ЗАКОНОМЕРНОСТИ СЕЛЕКЦИИ ПОЛИГОСТАЛЬНЫХ УБИКВИТАРНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ НА ПРИМЕРЕ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ТРЕХ ТАКСОНОВ Биология

Текст научной статьи на тему «ЗАКОНОМЕРНОСТИ СЕЛЕКЦИИ ПОЛИГОСТАЛЬНЫХ УБИКВИТАРНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ НА ПРИМЕРЕ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ТРЕХ ТАКСОНОВ»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 3, с. 430-441

= МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНЕТИКА =

УДК 579.253

ЗАКОНОМЕРНОСТИ СЕЛЕКЦИИ ПОЛИГОСТАЛЬНЫХ УБИКВИТАРНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ НА ПРИМЕРЕ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ

ТРЕХ ТАКСОНОВ

© 2015 г. О. Л. Воронина*, М. С. Кунда, Н. Н. Рыжова, Е. И. Аксенова, А. Н. Семенов, М. A. Курнаева, Ю. В. Ананьина, В. Г. Лунин, А. Л. Гинцбург

Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного ак. Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, 123098 Поступила в редакцию 19.09.2014 г. Принята к печати 17.12.2014 г.

Изучение гетерогенности популяций бактерий способствует контролю за состоянием природных очагов, возбудителями внутрибольничных инфекций, анализу эволюции микроорганизмов. Для исследования разнообразия и особенностей распространения полигостальных (имеющих широкий круг хозяев) убик-витарных (повсеместно распространенных) микроорганизмов родов Burkholderia, Leptospira и Listeria, относящихся к трем типам (филам) бактерий: Proteobacteria, Spirochaetes, Firmicutes, был использован метод мультилокусного секвенирования (MLST). По результатам анализа выборок определены превалирующие и уникальные для России генотипы, исследована их встречаемость в различных Федеральных Округах РФ, оценено сходство с генотипами глобального распространения. Выявлены общие закономерности селекции микроорганизмов, способных вызывать заболевания человека и животных. Показано, что все исследованные группы бактерий формируют генотипы, наиболее патогенные для макроорганизма. Штаммы таких генотипов бактерий Leptospira spp. и Listeria monocytogenes циркулируют длительное время, поддерживаемые природными очагами. В локальных географических зонах выявлено формирование большого разнообразия генотипов, различающихся по патогенности. Наиболее четкие зональные отличия по всем трем группам бактерий в Российской Федерации характерны для Дальневосточного Федерального Округа. Полученные данные будут способствовать анализу факторов отбора и изучению филогении исследованных таксонов.

Ключевые слова: Burkholderia cepacia comlex, Leptospira, Listeria monocytogenes, генотипирование, мультилокусное секвенирование, генотип.

THE REGULARITIES OF THE UBIQUITOUS POLYHOSTAL MICROORGANISMS SELECTION BY THE EXAMPLE OF THREE TAXA, by O. L. Voronina*, M. S. Kunda, N. N. Ryzhova, E. I. Aksenova, A. N. Semenov, M. A. Kurnaeva, Yu. V. Ananyina, V. G. Lunin, A. L. Gintsburg (Gamaleya Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of Russia, Moscow, 123098 Russia; *e-mail: kirolg3@newmail.ru). The investigation of the bacterial populations' heterogeneity contributes to the control of natural foci, causative agents of nosocomial infections, to the analysis of the microbial evolution. Multi Locus Sequence Typing (MLST) was employed for the analysis of the diversity and features of the distribution of the polyhostal, ubiquitous microorganisms of the genera Burkholderia, Leptospira and Listeria, belonging to three different phyla: Proteobacteria, Spirochaetes, and Firmicutes. According to the bacterial samples analysis microbial genotypes prevalent and unique to Russia were identified; their occurrence in different Federal Regions was investigated; their similarity with global spread genotypes was appreciated. The obtained results allowed identifying common regularities of the selection of the microorganisms capable to cause the diseases of human and animals. For all groups of bacteria the formation of genotypes, which are the most pathogenic for the macroorganism, was detected. Leptospira spp. and Listeria monocytogenes strains of such genotypes have been circulating for a long time, supported by natural foci. In the local geographic areas the formation of a wide variety of genotypes with different pathogenicity was demonstrated. In Russia, the zonal difference in all three groups of bacteria is most clearly traced to the Far Eastern Federal Region. The obtained data will contribute to the analysis of selection factors and investigation of the phylogeny of the studied taxa.

Keywords: Burkholderia cepacia complex, Leptospira, Listeria monocytogenes, genotyping, multi locus sequence typing, sequence type.

DOI: 10.7868/S0026898415030179

Принятые сокращения: Bcc — Burkholderia cepacia complex; MLST (Multi Locus Sequence Typing) — мультилокусное секвени-рование; ST (sequence type) — генотип; CC (donal сотр1ех) — клональный комплекс; SLV (Single-Locus Variant) — замена в одном локусе аллельного профиля; DLV (Double-Locus Variant) — замена в двух локусах аллельного профиля; ЦФО — Центральный Федеральный Округ; С-ЗФО — Северо-Западный Федеральный Округ; ПФО — Приволжский Федеральный Округ; СФО — Сибирский Федеральный Округ; ДФО — Дальневосточный Федеральный Округ; МВ — муковисцидоз.

* Эл. почта: kirolg3@newmail.ru

ВВЕДЕНИЕ

Представление о гетерогенности популяций бактерий, сформированное в рамках классической микробиологии, изменилось кардинальным образом с развитием молекулярно-генетического подхода, особенно методов секвенирования [1]. Метагеномные исследования микробиот многократно увеличивают объем сведений о разнообразии микроорганизмов, которое неслучайно, а опосредовано как биогеографическими условиями, так и антропогенными факторами. Торговые связи, миграция, перемещение животных и растений, развитие технологических производств, систем водоснабжения и охлаждения воды, лечебных центров — причина создания новых экологических ниш для адаптации бактерий, роста гетерогенности.

В изучении разнообразия бактерий, особенно условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, велика роль мультилокусного секвенирования (Multi Locus Sequence Typing, MLST), предложенного Maiden и соавт. в 1998 г. [2]. Метод характеризует воспроизводимость, стабильность, высокий коэффициент дискриминации Хантера-Гастона, который достигается уже при использовании в анализе семи локусов генома. Возможность оцифровки результатов обеспечивает их универсальность в обмене, хранении и анализе информации. По результатам секвенирования и идентификации аллель каждой мишени получает номер. Записанные в установленном порядке номера аллелей выбранных локусов генома определяют аллельный профиль, который, в свою очередь, нумеруется и называется ST (sequence type), или генотип в контексте генов MLST [3]. Разработаны программы для анализа как аллельных профилей, так и сцепленных последовательностей аллелей [3]. Все перечисленное определяет преимущества MLST в изучении разнообразия и структуры популяции бактерий. Применение MLST при анализе выборок Legionella pneumophila [4], Pseudomonas aeruginosa [5], Staphylococcus haemolyticus [6], Burkholderia cepacia comlex (Bcc) [7] позволило нам выявить ряд общих закономерностей отбора генотипов бактерий, которые особенно наглядны при рассмотрении убиквитарных (повсеместно распространенных) полигосталь-ных (имеющий широкий круг хозяев) микроорганизмов, проанализированных в данной работе.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Биологические образцы. Выборка штаммов Всс, а также клинических образцов (мокрота и трахеаль-ный аспират), содержащих Всс, исследована в два этапа. На первом этапе изучали внутрибольнич-ные штаммы, изолированные и сохраненные в коллекции ФГБУ "ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи"

Минздрава России, начиная с 1998 г., и штаммы от пациентов с диагнозом муковисцидоз (МВ), подробно описанные нами ранее [7]. На втором этапе, предварительно проверив возможность типи-рования фрагментов генов Bcc непосредственно в тотальной ДНК, выделенной из биологического материала [8], исследовали образцы мокроты и аспирата более чем трехсот российских пациентов, преимущественно больных МВ, а также отдельные штаммы из коллекции ФГБУ НЦЗД РАМН.

Штаммы Leptospira spp. получены из коллекции центра Минздрава России по лептоспирозам, работающего на базе лаборатории лептоспирозов ФГБУ "ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России. 58 штаммов, 29 из которых представляли собой референсные штаммы, 29 — изоляты, выделенные в разных регионах России, по итогам анализа зарегистрированы в базе данных MLST [9] под соответствующими номерами [10].

При анализе Listeria monocytogenes использовали осветленные лизаты культур из коллекции ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Выделение ДНК. Лизис клеток культур микроорганизмов Всс и Leptospira spp. проводили, как описано ранее [7]. ДНК из образцов мокроты и аспирата больных МВ выделяли согласно инструкции к набору реактивов "The Maxwell 16 Tissue DNA Purification Kit" на приборе "Maxwell MDX Instrument" ("Promega", США).

Определение видовой принадлежности культур микроорганизмов проводили на основе амплификации и секвенирования фрагмента гена 16S ри-босомной РНК как описано ранее [7]. Для видовой идентификации изолятов Leptospira spp. использовали последовательность фрагмента гена rpoB, кодирующего ß-субъединицу РНК-полиме-разы бактерий, согласно [11].

Мультилокусное секвенирование (MLST). Для

амплификации ДНК применяли следующие реактивы: Hot rescue DNA pol, 5 ед./мкл, ПЦР буфер 10х (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Россия), dNTP, 5 мM ("Медиген", Россия), праймеры ("Евроген", "Синтол", Россия).

Burkholderia cepacia complex (Всс). Для проведения MLST использовали модифицированную Spilker и соавт. схему, позволяющую различать 19 видов буркхолдерий, входящих в Bcc [12]. Схема включает следующие мишени для амплификации: atpD - ß-цепь АТР-синтетазы, gltB - большая субъединица глутаматсинтетазы, gyrB - субъединица B ДНК-гиразы, recA - рекомбиназа А, lepA - GTP-связывающий белок, phaC - ацетил-КоА-редуктаза, trpB - субъединица B триптофан-синтетазы. Модифицированная нами программа амплификации была одинакова для всех мишеней: 95°C - 10 мин, (95°C - 30 с, 63°C - 40 с, 72°C - 1 мин) х 35, 72°C - 5 мин.

Leptospira spp. Анализ коллекционных штаммов лептоспир проведен с помощью обновленной Boonsilp и соавт. методики MLST [13], в которой мишеньfadD заменена на caiB, что позволило распространить схему типирования на семь видов, признанных патогенными: L. alexanderi, L. borgpetersenii

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком