РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2015, том 55, № 4, с. 395-401
= МОЛЕКУЛЯРНАЯ РАДИОБИОЛОГИЯ :
УДК 577.2:611.018.21:539.1.047
ЗАМЕДЛЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ ОБРАЗОВАНИЯ И ДЕГРАДАЦИИ ФОКУСОВ YН2AX В ФИБРОБЛАСТАХ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА, ПОДВЕРГШИХСЯ ВОЗДЕЙСТВИЮ РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ
В МАЛЫХ ДОЗАХ
© 2015 г. А. К. Грехова1, 2, П. С. Еремин1, А. Н. Осипов1, 3 *, И. И. Еремин1, М. В. Пустовалова1, 3, И. В. Озеров1, Н. М. Сметанина1, 3, Н. Л. Лазарева1, Н. Ю. Воробьёва1, А. А. Пулин1, О. А. Максимова1, А. В. Гордеев1, А. Ю. Бушманов1, К. В. Котенко1
Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России, Москва 2Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва 3Институт химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН, Москва
Показано, что кинетика изменений количества фокусов уЫ2АХ (маркер двунитевых разрывов ДНК) в фибробластах кожи человека после воздействия рентгеновского излучения в малых дозах (20, 40 и 80 мГр) отличается от кинетики, наблюдаемой после облучения в умеренно низких дозах (160 и 250 мГр). После облучения в дозах 160 и 250 мГр наибольшее количество фокусов регистрировалось через 30 мин после воздействия радиации (первая экспериментальная точка), а далее наблюдалось снижение их уровня. При этом выделялась быстрая фаза (до 4 ч), за время которой происходит уменьшение количества фокусов ~ на 50—60%, и медленная фаза репарации (от 4 до 24 ч). Через 24 ч оставалось всего ~3—5% фокусов от количества, наблюдавшегося через 30 мин после облучения. После радиационного воздействия в малых дозах количество фокусов не снижалось в течение 2 ч, и даже через 24 ч после облучения их количество составляло ~25% от наблюдавшегося в точках максимума (1 ч после облучения в дозах 40 и 80 мГр и 2 ч после облучения в дозе 20 мГр).
Двунитевые разрывы ДНК, фокусы уИ2АХ, фибробласты, рентгеновское излучение, малые дозы. БО1: 10.7868/80869803115040037
Большая часть повреждений, возникающих в ДНК клеток после воздействия ионизирующего излучения (ИИ), существенно отличается по своей химической природе от эндогенных повреждений [1]. Важнейшей характеристикой радиацион-но-индуцированных повреждений ДНК является их сложность и кластеризация [2]. Среди повреждений ДНК, вызываемых ИИ, двунитевые разрывы (ДР) ДНК являются наиболее критическими для дальнейшей судьбы клетки. Предполагается, что именно ДР являются основным триггером, запускающим процессы клеточного отклика на воздействие ионизирующего излучения [3]. Репарация ДР ДНК происходит довольно медленно, в то время как ДР, не устраненные в ходе этого процесса, приводят к серьезным цитоге-нетическим нарушениям, гибели клеток, инактивации генов супрессоров опухолей или активации онкогенов [4—6]. Основные закономерности индукции ДР ДНК и их репарации довольно хорошо изучены при облучении в больших дозах [7]. Это
* Адресат для корреспонденции: 123182 Москва, ул. Живописная, 46, ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России; тел.: (499) 190-96-83; е-таП: andreyan.osipov@gmail.com.
обусловлено тем, что классические методы анализа ДР, основанные на изменении степени фрагментации двунитевой ДНК (электрофоретиче-ская подвижность, вязкость, седиментация и т.д.), не позволяли оценивать изменения количества ДР при дозах меньше единиц или даже десятков Гр [8]. В последние десятилетия стали стремительно развиваться высокочувствительные методы косвенной оценки изменений количества ДР в живых клетках, основанные на иммуноцитохи-мическом анализе белков, участвующих в репарации ДР ДНК. Образующиеся во время репарации ДНК от ДР сложные динамические микроструктуры, состоящие из тысяч копий белков, визуализируются после иммуноцитохимического окрашивания в виде ярких точек, из-за чего и получили в литературе название фокусов белков репарации (англ. foci). Полагают, что один фокус соответствует сайту репарации одного ДР [9]. Количественный анализ фокусов белков репарации в настоящее время считается самым чувствительным методом анализа ДР ДНК и позволяет детектировать увеличение количества ДР ДНК при малых дозах облучения (меньше 100 мГр) [10, 11]. При этом наибольшее развитие получил иммуно-
396
ГPEХOВA и др.
цитохимический анализ фокусов фосфорилиро-ванного корового гистона Н2АХ (уН2АХ). Фос-форилирование Н2АХ осуществляется киназами АТМ, ATR и DNA-PK в ответ на образование ДР и свидетельствует о его распознавании [11]. В настоящее время существует много работ, посвященных изменениям количества фокусов уН2АХ в клетках млекопитающих, подвергшихся воздействию радиации в малых дозах [12—14]. Однако, до сих пор, это одна из наиболее дискутируемых и спорных тем в современной радиационной биологии.
Цель нашей работы состояла в изучении закономерностей изменений количества фокусов уН2АХ в первичных культурах фибробластов кожи человека в различное время после облучения в малых (20, 40 и 80 мГр) и умеренно низких (160 и 250 мГр) дозах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Исследования выполнены на первичных культурах фибробластов, выделенных из биоптатов кожи здоровых добровольцев (мужчины 50— 52 лет). После подписания информированного согласия донору под местной анестезией 2%-ным раствором лидокаина проводили надрез кожи в заушной области площадью 2 х 2 мм. Биоптат помещали в среду для транспортировки (DMEM, содержащая 1 г/л D-глюкозы, 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, антибиотики) и немедленно доставляли в лабораторию.
Ткани биоптатов подвергали ферментативной обработке коллагеназой II типа ("Sigma", Австрия), и полученные суспензии одиночных фибробластов культивировали в течение 28 сут при 37°C, 5% CO2 в стандартной культуральной среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (4.5 г/л) ("StemCell Technology", США) с добавлением 2ммоль/л L-глутамина ("StemCell Technology", США), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина ("StemCell Technology", США) и 20% фетальной сыворотки крупного рогатого скота ("Biological Industries", Израиль). В дальнейшем клетки снимали с поверхности флаконов 0.05%-ным раствором трипсина и пассировали с плотностью 1.5—2.0 х 104 клеток/см2 в той же культуральной среде, но с уменьшенным до 10% содержанием фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Клетки пассировали при достижении культурой 80—90% монослоя. Замену среды осуществляли каждые 3 сут. В работе использовали культуральную посуду фирмы "Corning-Cos-tar" (США), реактивы фирмы "Sigma" (США).
Ранее заготовленные криопробирки с культурами клеток фибробластов быстро размораживали при 37°С, затем, медленно перемешивая, добавляли по капле стандартную культуральную
среду до объема 50 мл. Aликвоту клеточной суспензии отбирали для оценки жизнеспособности клеток на автоматическом счетчике клеток "Countess" ("Invitrogen", СШA) согласно протоколу производителя. После разморозки жизнеспособность клеток во всех образцах составляла не менее 92%. Клетки культивировали в течение 3 сут в полной среде.
В дальнейшем экспериментальные и контрольные культуры снимали с пластика раствором трипсина с 0.25% ^ATA ("StemCell Technology", СШA), инактивацию трипсина и отмывку клеток проводили в полной среде. Клетки пассировали в 35 мм чашки Петри, на покровные стекла ("SPL Lifesciences", Южная Корея). Для экспериментов использовали клетки в фазе экспоненциального роста (плотность клеточной популяции ~70%).
Облучение клеток проводили на рентгеновской биологической установке РУБ РУСТ-М1 (Россия), оснащенной двумя рентгеновскими излучателями, при мощности дозы 40 мГр/мин, напряжении 100 кВ, токе 0.8 мA, фильтре 1.5 мм Al, и температуре 4°C (для охлаждения использовались термогранулы "LAB ARMOR BEADS"). Погрешность отпускаемой дозы не превышала 15%. После облучения клетки инкубировали в стандартных условиях CO2 инкубатора (37°C, 5% CO2) в течение 0.5—24 ч.
Клетки на покровных стеклах фиксировали параформальдегидом (4% в фосфатно-солевом буфере, рН 7.4) в течение 20 мин при комнатной температуре, после чего дважды промывали (рН 7.4). Пермеабилизировали 0.3% Тритон-Х100 в фосфатно-солевом буфере (рН 7.4), содержащем 2% бычьего сывороточного альбумина для блокирования неспецифического связывания. Слайды инкубировали с мышиными моноклональными антителами к белку y^AX (Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, "Merck-Millipore", СШA), разведенными в соотношении 1/400 в фосфатно-солевом буфере (рН 7.4), содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина, в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем промывали фосфатно-солевым буфером (рН 7.4) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч с вторичными антителами, конъюгированными с флуорохромом Alexa Fluor 555 (Goat Anti-Mouse IgG (H + L), "Life Technologies", COA), разведенными в соотношении 1/1000 в фосфатно-солевом буфере (рН 7.4), содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина. Для окраски ДНК и предотвращения фотовыцветания использовали содержащую DAPI заключающую среду ProLong Gold ("Life Technologies", COA). Визуализацию, документирование и обработку иммунноцитохимиче-ских микроизображений осуществляли на люминесцентном микроскопе Nikon Eclipse Ni-U
("Nikon", Япония), оснащенном видеокамерой высокого разрешения ProgRes MFcool ("Jenoptik AG", Германия) с использованием наборов светофильтров DAPI (340—380 нм возбуждение и 435— 485 нм эмиссия) и Y-2E/C (540—580 нм возбуждение и 600—660 нм эмиссия). Анализировали не менее 200 клеток на точку. Для подсчета количества фокусов уН2АХ использовали программу Fo-cicounter (http://focicounter.sourceforge.net/).
Статистический и математический анализ полученных данных проводился с использованием пакета статистических программ Statistica 8.0 (StatSoft). Результаты исследований представлены как среднее арифметическое результатов трех независимых экспериментов ± стандартная ошибка.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В ходе работы было проведено детальное изучение изменений количества фокусов yH2AX в фибробластах кожи человека в зависимости от дозы и времени после облучения. Считается, что максимум фосфорилирования Н2АХ наступает через 15—30 мин после облучения [15]. Исходя из данных литературы предполагалось, что зависимость среднего количества фокусов yH2AX в кл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.