БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 8, с. 1024 - 1030
УДК 577.152.344
ЗАПАСНОЙ 11S ГЛОБУЛИН СЕМЯН ТЫКВЫ: ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОТЕОЛИЗА ПАПАИНОМ
© 2014 А.С. Рудакова, С.В. Рудаков, И.А. Каховская, А.Д. Шутов*
Государственный университет Молдовы, MD-2009 Кишинев, ул. Матеевича, 60; факс: (37)322-244248, электронная почта: shutovandrei@yahoo.com
Поступила в редакцию 11.04.14 После доработки 14.05.14
В ходе гидролиза папаином кукурбитина, запасного 11S глобулина из семян тыквы Cucurbita maxima, наблюдается ограниченный протеолиз а- и ß-цепей и глубокое расщепление aß-субъединиц по кооперативному (one-by-one) механизму. Независимый анализ кинетики ограниченного и кооперативного протеолиза кукурбитина обнаруживает два последовательных этапа реакции. На первом этапе происходит ограниченный протеолиз, заключающийся в отщеплении коротких концевых пептидов а- и ß-цепей. Кооперативный протеолиз, протекающий как реакция псевдопервого порядка, начинается на втором этапе. Таким образом, ограниченный протеолиз на первом этапе играет регуляторную роль, оказывая влияние на скорость глубокого расщепления молекул кукурбитина по кооперативному механизму. Способность кукурбитина к кооперативному протеолизу, по-видимому, приобретается в результате его структурных изменений в ходе ограниченного протеолиза. Вероятные структурные изменения молекулы кукурбитина при ограниченном протео-лизе обсуждаются на основе анализа третичной структуры субъединицы кукурбитина pdb|2EVX в сопоставлении с ранее полученными данными о закономерностях протеолиза папаином 11S глобулина сои.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Cucurbita maxima, запасной глобулин семян, ограниченный протеолиз, папаин, кинетика.
118 глобулин (легумин) и 78 глобулин (вици-лин) являются наиболее характерными запасными белками в семенах растений [1]. К настоящему времени накоплен обширный материал, описывающий первичные и высшие структуры 118 и 78 глобулинов [2] и их эволюционный путь, восходящий к бактериальным оксалатде-карбоксилазам [3]. Сопоставление весьма консервативных аминокислотных последовательностей и третичных структур запасных глобулинов приводит к выводу об общности принципов структурной организации их субъединиц.
Субъединицы 118 глобулинов состоят из соединенных дисульфидной связью ^-концевого (а-цепь) и С-концевого ф-цепь) доменов [2]. N и С-концевые домены субъединиц гомологичны и структурно эквивалентны. Структурной основой доменов является в-баррель из восьми антипараллельных в-стрендов БСБЕ-ВОН1 (рис. 1), соединенный с дополнительными антипараллельными в-стрендами А, А и /, /'. В структуре а-цепей петля между стрендами Е и В образует дополнительные в-стренды Е' и В'. Последовательность между стрендами / и /' об-
* Адресат для корреспонденции.
разует группу a-спиралей hi, h2 и h3. Дополнительная a-спираль h0 образована последовательностью между стрендами A и B.
Зрелая гексамерная молекула 11S глобулинов образуется в результате соединения двух тримеров субъединиц. Существенную роль в формировании четвертичной структуры 11S глобулинов играют взаимодействия между соседствующими в тримерах a-спиралями h1-h3 a- и р-цепей [4, 5].
Менее подробно исследованы закономерности деградации запасных глобулинов в прорастающих семенах, являющейся неотъемлемой частью их функции. Деградация запасных глобулинов in vivo при прорастании семян и in vitro происходит в результате двух принципиально различающихся механизмов протеолиза — ограниченного и кооперативного [3]. Ограниченный («zipper» [6]) протеолиз обусловлен присутствием в молекулах белкового субстрата специфических областей полипептидных цепей с повышенной чувствительностью к протеолитической атаке. Деградация белка по кооперативному механизму (one-by-one [6]), зависящая от его кон-формационного состояния [7], заключается в поодиночном глубоком расщеплении молекул субстрата [3, 6].
В зависимости от конформации запасного глобулина, его нативные молекулы могут быть чувствительны (либо нечувствительны) к кооперативному протеолизу. Так, плотность упаковки третичной структуры 78 глобулина сои относительно низка, и при действии папаина его рас-
щепление по кооперативному механизму происходит вне зависимости от ограниченного про-теолиза, протекающего параллельно [8]. Напротив, нативный 78 глобулин фасоли, отличающийся относительно высокой плотностью упаковки его молекулы [8], нечувствителен к ко-
а
Рис. 1. Структура а-цепи 11S глобулина тыквы кукурбитина pdb|2EVX. а — Ленточная диаграмма третичной структуры. Бесструктурные участки 1—4 показаны пунктирными линиями. Темная часть диаграммы соответствует С-концевому участку, предположительно отщепляемому в ходе ограниченного протеолиза в результате расщепления бесструктурного участка 3 между остатками Е191 и Е204. Остаток цистеина Cys103 участвует в образовании дисульфидной связи с ß-цепью; б — структурно выровненные аминокислотные последовательности а-цепей кукурбитина 2EVX и глицинина сои 1OD5. Цифры в квадратных скобках соответствуют числу остатков в бесструктурных участках кукурбитина и глицинина. Жирным шрифтом выделены остатки с повышенной (64—75%) доступностью растворителю. С-концевая область последовательности глицинина, показанная курсивом, отщепляется при гидролизе папаином [5]
оперативному протеолизу при действии разнообразных протеиназ [9]. Лишь после завершения ограниченного протеолиза, приводящего к закономерным изменениям его нативной структуры, 7S глобулин фасоли приобретает способность к деградации по кооперативному механизму [9]. Такой тип протеолиза был также показан при гидролизе папаином 11S глобулина сои [5].
В настоящей работе исследованы взаимоотношения между ограниченным и кооперативным протеолизом при гидролизе кукурбитина, 11S глобулина тыквы. В качестве модельной протеиназы использован папаин, поскольку гомологичные папаиноподобные протеиназы ответственны за мобилизацию запасных глобулинов в прорастающих семенах [10].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Обезжиренную муку из семядолей тыквы (Cucurbita maxima) промывали водой в соотношении 1 : 70 (вес/объем) для удаления белковых и небелковых примесей. Остаток муки экстрагировали 0,5 М NaCl в буфере А (0,02 М Tris-HCl, рН 8,0, 0,02%-ный NaN3, 1 мМ ЭДТА) в соотношении 1 : 10 (вес/объем). Кукурбитин осаждали из экстракта добавлением сульфата аммония до концентрации 40%-ного насыщения. Осадок растворяли в 3,0 М NaCl в буфере А, и раствор вносили в колонку фенил-сефарозы CL-4B («Pharmacia Biotech», Швеция), уравновешенной 3,0 М NaCl в буфере А. После удаления неадсорбирующейся фракции кукурбитин элюировали 2,0 М NaCl в буфере А.
Для гидролиза кукурбитина реакционную смесь, содержащую 5 мг/мл субстрата и 50 мкг/мл папаина («Sigma Life Science», США) в буфере Б (рН 6,8, 32,25 мМ Na2HPO4, 4,75 мМ лимонная кислота, 0,417 М NaCl, 0,02%-ный NaN3 и 10 мМ 2-меркаптоэтанол) инкубировали 14 ч при 30°. Для исследования хода гидролиза периодически отбирали аликвоты инкубационной смеси и реакцию останавливали добавлением ТХУ до конечной концентрации 5% (вес/объем).
DS-Na-ПААГ-электрофорез проводили в 15%-ном (вес/объем) геле в буферной системе Лэммли [11]. Перед электрофорезом остаточную ТХУ в осажденных белковых образцах удаляли промывкой ацетоном, осадки высушивали и растворяли в стандартных условиях в буфере, содержащем или не содержащем 2-меркатоэта-нол. Использовали молекулярные маркеры «Fermentas Life Sciences» (Литва). В качестве дополнительных маркеров использовали полипептиды зрелого 11S глобулина сои, аминокис-
лотные последовательности которого известны [4]. Электрофореграммы сканировали (ImageScanner III, GE «Healthcare», Великобритания) и анализировали с использованием программы Pho-retix 1D Gel Analysis v.5.10. Относительные молярные количества полипептидов, обнаруживаемых электрофорезом в интактном кукурбитине и остаточном белке после протеолиза, рассчитывали по данным их молекулярных масс и относительных весовых концентраций.
Уровень доступности растворителю аминокислотных остатков в третичной структуре белка (в процентах от доступности растворителю остатка X в пентапептиде GGXGG) рассчитывали с помощью программы DeepView/Swiss-Pdb-Viewer v.3.7. Эту же программу использовали для структурного выравнивания аминокислотных последовательностей и построения ленточных диаграмм.
Для анализа кинетики протеолиза остаточный ТХУ-осаждаемый белок в гидролизатах определяли по связыванию красителя [12]. Сред-нечисленную молекулярную массу субъединиц исходного белка и его высокомолекулярного остатка в гидролизатах рассчитывали по данным молекулярной массы полипептидов, обнаруживаемых электрофорезом, и их относительному весовому содержанию. Концентрацию остаточного белка в гидролизатах Pt и его среднечис-ленную молекулярную массу Mt выражали в % от соответствующих исходных величин P° и M°.
Анализ кинетики протеолиза проводили, руководствуясь ранее описанной стратегией [5]. При смешанном механизме протеолиза, когда ограниченный и кооперативный протеолиз протекают либо параллельно независимо друг от друга, либо последовательно, вклад ограниченного протеолиза в общее снижение весовой концентрации белка в гидролизате (P°^Pt) равен M%°—M%t. Следовательно, уравнение P%t + + (M%°—M%t) = f(t) описывает кинетику исключительно кооперативного протеолиза, протекающего как реакция псевдопервого порядка [13, 14]. Соответственно, изменение в ходе реакции относительной величины молекулярной массы белкового субстрата (M%°^M%t) описывает кинетику исключительно ограниченного протеолиза.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
По данным электрофореза, субъединицы исходного кукурбитина состоят из группы близких по молекулярной массе а-цепей а (кажущаяся масса 34,8 кДа) и минорной а-цепи а' (24,0 кДа), и трех ß-цепей (22,4, 21,5 и 20,8 кДа). Таким об-
разом, в состав олигомерной молекулы кукурби-тина входит, по меньшей мере, три типа субъединиц (рис. 2, трек 1). Аминокислотная последовательность только одной из них (рёЪ|2ЕУХ с молекулярными массами а- и р-цепей 31,5 и 20,9 кДа соответственно) известна. Вероятно, приведенная выше кажущаяся молекулярная масса а-цепей а завышена,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.