МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 2, с. 204-210
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 582.282.232.044
ЗАЩИТА БАССНАЯОМУСЕБ СЕЯЕУШАЕ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛАМИ ОТ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО И РАДИАЦИОННОГО ПОРАЖЕНИЯ
© 2004 г. И. Ю. Степаненко*, М. Г. Страховская**, Н. С. Беленикина**, Ю. А. Николаев*, А. Л. Мулшкин*, А. Н. Козлова*, А. А. Ревина***, Г. И. Эль-Регистан*
*Институт микробиологии РАН, Москва **МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва ***Институт электрохимии им. АН. Фрумкина РАН, Москва Поступила в редакцию 20.12.02 г.
Исследовано влияние С7-алкилоксибензола (С7-АОБ) и парагидроксиэтилфенола (тирозола), химических аналогов микробных ауторегуляторов анабиоза, на сохранение жизнеспособности дрожжевыми клетками в условиях окислительного стресса разной природы. Стресс вызывали воздействием активных форм кислорода (АФК), образующихся при у-облучении клеточных суспензий дозами 10-150 крад, интенсивностью 194 рад/с, или синглетного кислорода, который генерировался в клетках, фотосенсибилизированных хлорином е6 (10 мкг/л). Обнаружено, что С7-АОБ оказывает протекторный эффект, защищая дрожжевые клетки от у-радиации (50 крад) в вариантах с превентивным его внесением в клеточные суспензии за 30 мин до облучения в диапазоне концентраций 0.050.16% (вес/об). Защитное действие С7-АОБ выражалось как в поддержании жизнеспособности клеток при облучении, так и в восстановлении их пролиферативной способности после облучения. В экспериментах с фотодинамической инактивацией клеток впервые обнаружено защитное действие антиоксиданта фенольной природы, С7-АОБ от генерируемого в клетках синглетного кислорода. Анализ разностных спектров поглощения окисленных производных С7-АОБ предполагает, что защитный механизм действия С7-АОБ заключается в перехвате генерируемых при окислительном стрессе АФК. Отсутствие фотозащитных функций у тирозола свидетельствует о том, что антиоксидантные свойства микробных АОБ и их шаперонные функции не связаны. Полученные в работе результаты расширяют спектр антиоксидантных и стрессопротекторных свойств фенольных соединений.
Ключевые слова: стресс, дрожжи, защита, алкилоксибензолы, антиоксидантная активность, радиопротекторная активность.
Генерация свободных радикалов, в том числе активных форм кислорода (АФК) является обязательным атрибутом аэробной жизни. Функционирование и развитие клеток в кислородсодержащем окружении не могло бы быть возможным без существования защитных систем, включающих как специализированные ферменты, так и низкомолекулярные антиоксиданты. Стрессор-ные воздействия, которые опосредуются в клетке накоплением АФК, и нарушения в ее защитных системах приводят к возникновению окислительного стресса, сопровождающегося повреждениями субклеточных структур, что является причиной целого ряда физиологических и патофизиологических феноменов и таких процессов, как старение, канцерогенез, развитие злокачественных образований и др. [1].
В последнее время значительно возрос интерес к изучению роли низкомолекулярных метаболитов, и особенно - внеклеточных ауторегуляторов, в защите клеток от окислительного стресса. В дополнение к ферментным системам защиты, в тушении АФК задействованы липиды, аминокисло-
ты, нуклеотиды и другие соединения. Одними из мощных неферментативных протекторов от окислительного стресса являются фенольные соединения, которые широко распространены в микробных и растительных организмах [2]. Так выраженная антиоксидантная активность показана для микробных алкилоксибензолов (АОБ), которые выполняют функцию аутоиндукторов анабиоза (ауторегуляторные факторов ё1) [3, 4]. Накапливаясь в развивающихся культурах микроорганизмов до порогового уровня, АОБ вызывают переход культуры в стационарную фазу, а при дальнейшем повышении концентрации - образование покоящихся форм, устойчивых к повреждающим воздействиям (в том числе к у-облучению и окислительному стрессу) [5]. Механизм молекулярного действия АОБ как аутоиндукторов анабиоза обусловлен их способностью повышать степень микровязкости мембран и индуцировать дегидратацию клеток [6], а также их свойствами химических шаперонов [7]. Образуя лабильные комплексы с молекулами ферментов, АОБ изменяют их конформацию, вследствие чего изменя-
ЗАЩИТА SACCHAROMYCES CEREVISIAE
205
ется каталитическая активность и существенно возрастает стабильность белковых биополимеров [7, 8]. Отметим, что участие АОБ в формировании неферментативной системы антирадикальной защиты клеточных структур играет особенно важную роль в покоящихся формах в условиях ин-гибирования метаболических активностей клетки, в том числе - антиоксидантных ферментов [9].
Протекторное действие АОБ в вегетативных клетках при стрессорных воздействиях практически не исследовано. Одним из защитных эффектов АОБ является их функционирование как ловушек активных форм кислорода, так как для фенольных соединений показана способность служить перехватчиками активных форм азота и кислорода (супероксидного анион радикала, гидроксильного радикала, перекиси водорода) [10-12]. В то же время мало известно о защитных свойствах фенольных соединений от реакций, опосредованных синглет-ным кислородом.
Поэтому представлялось целесообразным исследовать влияние индивидуальных АОБ на сохранение жизнеспособности дрожжевыми клетками в условиях окислительного стресса разной природы, вызванного радиационного-химическим образованием АФК под действием у-излучения, или генерируемых в фотосенсибилизированных клетках.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объекта исследования использовали штамм Saccharomyces cerevisiae ВКМ Y-380. Дрожжи выращивали в жидкой питательной среде (сусле 3.5 балл) в колбах объемом 250 мл (50 мл среды) на качалках (200 об/мин) при 28-30°С. Инокулятом служила культура экспоненциальной фазы роста. Инокулят вносили в количестве, дающем начальную оптическую плотность (ОП, при X = 660 нм) клеточной суспензии 0.2 (Specord, l = 10 мм). Жизнеспособность дрожжей определяли при высеве соответствующих разведений клеточных суспензий на плотную среду (сусло-агар) по числу колониеобразующих единиц (КОЕ). Высевы производили через 30 мин и 2 ч после у-облучения или монохроматического лазерного облучения.
В работе применяли химические аналоги ауто-регуляторных факторов d1 бактерий С7-алкилок-сибензол (С7-АОБ) в водорастворимой форме и тирозол (парагидроксиэтилфенол) (0.05-0.16% вес/об), синтезированные в МИТХТ им. М.В. Ломоносова со степенью очистки 99.9%. Реакцию радиационного окисления моделировали в условиях стационарного радиолиза на установке у-60Со (ГУРХ 100000 Института электрохимии им. А.Н. Фрумкина, РАН) с интенсивностью облучения 194 рад/с.
КОЕ/мл х 107
крад
Рис. 1. Влияние дозы у-радиации на жизнеспособность дрожжей Б cerevisiae.
При исследовании антиоксидантных свойств АОБ в отношении синглетного кислорода (102) для его генерации в работе использовали фотосенсибилизатор (ФС) хлорин е6 [12]. ФС вносили в суспензию дрожжей в концентрации 10 мкг/л и через 30 мин клетки облучали монохроматическим лазером 662 нм (20 мВт/см2).
Спектры поглощения растворов АОБ регистрировали на спектрофотометре ИйаеЫ-550 (Япония).
Повторность измерений в экспериментах пятикратная при постановке трех независимых серий опытов. Представленные результаты отражают усредненные величины; статистический анализ данных проводили с использованием теста Стьюден-та, принимая критерий доверенности Р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Все биологические объекты обладают разной чувствительностью к радиации, поэтому предварительно необходимо было подобрать такую дозу у-излучения, при которой число выживших клеток составило бы менее 50%. Для этого культуры дрожжей Б. cerevisiae экспоненциальной фазы роста (ОП = 4.5) подвергали действию различных доз ионизирующего излучения в интервале от 10 до 150 крад. Число жизнеспособных клеток через 30 мин после воздействия радиации определяли по величинам КОЕ. При возрастании дозы облучения наблюдали снижение количества жизнеспособных клеток (рис. 1). Кроме того, при определении численности КОЕ была отмечена задержка роста колоний облученных дрожжей на 1-2 сут в зависимости от дозы радиации и наличие большого количества микроколоний (более 50% от общего числа колоний) в отличие от контрольных вариантов, где развивались макроколонии. Для дальнейших исследований была выбрана доза ионизирующего излучения, эквивалентная 50 крад, после воздействия которой процент жизнеспособных клеток в культуре составлял 35% от исходного количества.
КОЕ, %
Рис. 2. Влияние концентраций С7-АОБ на численность жизнеспособных дрожжей Б. cerevisiae в острых опытах. Время прединкубации: 1 - 30 мин; 2 - 2 ч. За 100% принята численность жизнеспособных клеток в пробах, не обработанных АОБ, определяемая после отбора проб.
Прежде, чем изучать протекторные эффекты С7-АОБ в условиях окислительного стресса, определили их влияние на концентрацию жизнеспособных клеток дрожжей (рис. 2). Эксперименты проводили с пробами, отобранными из экспоненциально растущей культуры Б. cerevisiae в количестве 3 мл. В опытные варианты вносили 0.1 мл раствора АОБ необходимой концентрации, инкубировали при 28°С без принудительной аэрации в течение 30 мин и 2 ч. О действии экзогенно вносимого С7-АОБ (0.1-1.6 г/л) судили по изменению численности КОЕ после высева на плотные среды. Численность КОЕ в пробах без внесения АОБ была принята за 100%.
Из полученных данных (рис. 2) следует, что обработка дрожжей С7-АОБ (0.1-1.0 г/л, 30 мин) приводила к повышению концентрации КОЕ на 1257%, что согласуется с данными о ростстимулирую-щем действии антиоксидантов фенольной природы [13]. При повышении концентрации С7-АОБ до
1.6 г/л численность жизнеспособных клеток снижалась на 18%. Через 2 ч в пробах дрожжей без внесения АОБ наблюдалось увеличение КОЕ на 20% по сравнению с пробой, высеянной через 30 мин после отбора. В вариантах с 2-часовой прединкубацией клеточной суспензии с С7-АОБ (0.5-1.4 г/л) наблюдали снижение КОЕ на 5-35% (в зависимости от концентрации). Таким образом, действие С7-АОБ на культуру Б. cerevisiae зависело от его концентрации в суспензии дрожжей и времени прединкубации
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.