УДК: 577.151.158,661.97.616.99
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
ЗАЩИТНАЯ РОЛЬ ГИПОТАЛАМИЧЕСКОГО ОБОГАЩЕННОГО ПРОЛИНОМ ПЕПТИДА ПРИ ОСТРОЙ ИНТОКСИКАЦИИ КРЫС ДВУОКИСЬЮ УГЛЕРОДА В УСЛОВИЯХ КИСЛОРОДНОГО ГОЛОДАНИЯ © 2013 г. Р. М. Симонян1, Л. Г. Мелконян2, М. А. Бабаян1, *, Г. М. Симонян1, Л. Н. Аракелян1,
М. А. Симонян1, А. А. Галоян1
Институт биохимии им. Г. Бунятяна Национальной Академии наук Республики Армения, Ереван Государственный педагогический институт им. М. Налбандяна, Гюмри, Республика Армения
С использованием спектрального анализа определяли содержание МАВРЫ оксидаз (Мох) в мембранах эритроцитов, клетках селезенки и костного мозга, в ядрах клеток селезенки, а также в сыворотке крови крыс, подвергнутых действию двуокиси углерода в условиях кислородного голодания. Показано, что при интоксикации СО2 некоторое увеличение содержания Мох в исследуемых фракциях коррелирует с повышением супероксид-продуцирующей активности Мох. Внутрибрюшинное введение крысам за 1 ч до подачи СО2 синтетического аналога обогащенного пролином пептида, ранее выделенного из нейросекреторных гранул гипоталамуса и названного галармином, приводило к дальнейшему повышению содержания и супероксид-продуцирующей активности Мох. Ферригемо-глобин-восстанавливающая активность Мох, сниженная в результате интоксикации СО2, повышалась в присутствии галармина. Показано также, что значительные изменения активностей суперок-сиддисмутазы и каталазы в цитозоле эритроцитов и клеток селезенки крыс, вызванные действием СО2, корректируются в присутствии галармина и приближаются к норме. В итоге значительно снижается количество погибших животных. Полученные результаты позволяют предположить, что га-лармин может оказывать защитное действие при интоксикации под действием СО2 в условиях кислородного голодания.
Ключевые слова: двуокись углерода, интоксикация, кислородное голодание, МАОРИоксидаза, металло-протеины, обогащенный пролином пептид, галармин.
DOI: 10.7868/S1027813312040127
ВВЕДЕНИЕ
Механизмы токсического действия двуокиси углерода (СО2), сопровождающегося кислородным голоданием млекопитающих, в настоящее время изучены недостаточно. СО2 вызывает снижение процентного содержания О2 в воздухе, что приводит к кислородному голоданию и изменениям метаболизма активных форм кислорода (АФК). При сублимации сухого льда содержание СО2 в воздухе повышается в среднем от 5% до 18%, что является потенциальной угрозой для людей, находящихся в среде с повышенным содержанием СО2 [1—3]. Механизмы токсического действия СО2 связаны с сужением капиллярных сосудов легких, изменением метаболизма сфин-гомиелиназы, протеинкиназы и повышением
уровня супероксидных радикалов (О-), продуцируемых различными NADPH оксидазами (Nox), в
* Адресат для корреспонденции: 0014 Ереван, ул. П. Севака, 5/1; тел.: +374 10 28 18 32; e-mail: mbabayan@biochem.sci.am.
частности, оксидазой с молекулярной массой 47 кДа (p47 phox) в эпителиальных клетках капилляров. Гипоксия ассоциируется и с повышением уровня О - ферментом Nox 4 in vitro и in vivo. Определенная роль приписывается и нитриток-сидсинтазе, участвующей в процессах пролиферации и миграции клеток эндотелиальных сосудов [4]. При аноксии и реоксигенации в тромбоцитах
также происходит повышенное продуцирование О -и тромбоксана В2, которое подавляется пептидами, ингибирующими Nox 2, витамином С и ингибитором фосфолипаз А2 [5]. Если при гипоксии в накоплении АФК участвуют, главным образом, различные изоформы Nox, то при реоксигенации организма — ксантиноксидаза [6]. При кислородном голодании у пациентов с хронической легочной недостаточностью наблюдается снижение активности глутатионпероксидазы в эритроцитах, а активности каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) практически не изменяются. Причем, наблюдается существенное повышение уровня продукта перекисного окисления липидов — малоно-
вого диальдегида (МДА) в плазме крови и в итоге возникает дисбаланс между анти- и прооксидант-ными системами [7]. При воспалении брюшины у крыс под влиянием С02 (5—10 мм ртутного столба) происходит повышение уровня АФК (О-) и подавление активности СОД [8]. При давлении кислорода на высоте 5700 м (гипобарическая гипоксия) эритроциты крыс подвергаются окислительному стрессу на фоне снижения активностей СОД и каталазы и повышения уровня МДА, в то время как витамины Е, С, а также L-карнигин оказывают антистрессорное действие [9]. При прерывистой гипоксии препарат генистеин оказывает ан-тистрессорное действие, регулируя уровни СОД и каталазы и снижая уровень МДА в клетках мышц рта у крыс [10].
Фактически, при гипоксии адаптационные механизмы организма бережно используют малые дозы кислорода и активируют образование супероксидов с участием Мох, которые переводят электрон от МАЭРИ цитозоля к транс-мембранному кислороду, превращая его в О-. Последние, в свою очередь, являются интермедиатами, крайне необходимыми для аэробных метаболических окислительно-восстановительных процессов, происходящих, в частности, в иммунной системе, митохондриальном дыхании и геноме. С повышением уровня супероксидов, в основном, повышается уровень антиоксидантных ферментов: глутатионпероксидазы, СОД и каталазы, которые оказывают защитное действие при кислородном голодании. Эффективны те антиоксиданты, которые нейтрализуют перекись водорода (как продукт ферментативного дисмутирования О-) или являются скавенджерами гидроксильных радикалов (НО*), образующиеся при расщеплении Н2О2 ионами переходных металлов и являются энергичными деградирующими агентами для анти- и прооксидантных металлопротеинов [11—13].
Представляется важным определение содержания и активности изоформ Мох (ключевых
ферментов, продуцирующих О-) из мембран эритроцитов, мембран клеток селезенки и костного мозга, из ядер клеток селезенки, а также из сыворотки крови (для анализа уровня экстрацел-люлярной Мох) крыс, подвергнутых действию СО2. Опыты проводили в отсутствие или в присутствии синтетического аналога обогащенного пролином пептида, ранее выделенного из нейро-секреторных гранул гипоталамуса и названного галармином. Галармин повышает как МАЭРИ-
зависимую О --продуцирующую, так и ферриге-моглобин-восстанавливающую активности изоформ Мох, которые играют роль рецепторов для галармина [14, 15] и стимулирует иммунную си-
стему и кислородный гомеостаз млекопитающих [16, 17].
Целью данного исследования было определение уровня и активности Мох в клетках указанных тканей крыс с использованием спектрального анализа при интоксикации животных СО2 в отсутствие и в присутствии галармина, вводимого внутрибрюшинно в профилактическом режиме.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Условия интоксикации крыс двуокисью углерода. Белых половозрелых крыс (12 животных, массой 230—250 г) помещали в камеру с верхним отверстием, куда подавался СО2 при давлении 20 мм ртутного столба. Крысы были разделены на три группы: контрольную группу (К) и две подопытные (I, II), по 6 крыс в каждой. Животным опытной группы I (ОГ-1) внутрибрюшинно вводили по 0.5 мл физиологического раствора за час до подачи СО2. Животным ОГ-П внутрибрюшинно вводили галармин (по 20 мкг/кг веса животного, в 0.5 мл физраствора) в профилактическом режиме, за час до подачи СО2. Подача СО2 продолжалась в течение 95—100 мин. Контрольным крысам вводили 0.5 мл физраствора в аналогичном режиме.
В другой серии опытов животным ОГ-Ш (6 животных) вводили физраствор и подавали С02, а животным ОГ-ГУ (6 животных) вводили га-лармин в аналогичных условиях и подавали СО2 (подача СО2 животным ОГ-Ш и ОГ^У продолжалась в течение 120—125 мин). Далее осуществляли декапитацию крыс под легким эфирным наркозом. Кровь животных стабилизировали 0.2%-ным оксалатом натрия (в условиях легкого перемешивания), одновременно отделяли селезенку и костный мозг животных.
Выделение фракции изоформ Nox из мембран и ядер клеток селезенки крыс. После промывания селезенок (по 3 г) физиологическим раствором и взвешивания проводили гомогенизацию ткани (1 г) в 10 мл 0.25 М сахарозы в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в течение 1 мин при 4°С. Ядра клеток селезенки (ЯКС) осаждали центрифугированием гомогената при 3000 об/мин в течение 10 мин. Митохондрии удаляли центрифугированием полученного надосадочного раствора при 12000 об/мин в течение 15 мин. Мембраны клеток селезенки (МКС) осаждали центрифугированием полученного надосадочного раствора при 6000 об/мин при рН 5.6 в течение 15 мин. Далее осадки ЯКС и МКС промывали водой (1 : 100 об/об) и повторно центрифугировали (10000 об/мин, 10 мин). Очищенные от следов сахарозы и водорастворимых солей ЯКС и МКС смешивали с водой (1 : 5 об/об) и повторно гомогенизировали в аналогичном режиме. После солюбилизации фракции изоформ Мох из очищенных ЯКС и
МКС, удаления нерастворимых осадков центрифугированием и диализа надосадочных растворов против воды, фракции изоформ Мох из ЯКС и МКС подвергали ионообменной хроматографии на колонках с целлюлозой КМ-52 (для удаления следов гемоглобина и других сопутствующих белков). Не задержавшиеся на колонке с КМ-52 белковые фракции далее раздельно подвергали ионообменной хроматографии на колонке с целлюлозой ДЕ-52, уравновешенной 0.004 М калий-фосфатным буфером (КФБ). После промывания колонки водой, а затем 0.01 М КФБ при рН 7.4 изоформы Мох кислой природы из ЯКС или МКС элюировали 0.2 М КФБ [18].
Выделение фракции Nox из костного мозга крыс. Процедура получения фракции Мох из мембран клеток костного мозга (МККМ) включала те же этапы, что и при получении фракции МКС из селезенки, но использовали всего по 0.2 г ткани костного мозга [18].
Выделение фракции экстрацеллюлярной Nox из сыворотки крови крыс. Фракция экстрацеллюляр-ной Мох (еМох) из сыворотки крови крыс была получена методом ионообменной хроматографии на колонках с сефадексом ДЕАЕ А-50 и целлюлозой ДЕ-52. Следы эритроцитов и клеток плазмы крови крыс удаляли центрифугированием при 14000 об/мин, 15 мин. Супернатант (светло-розового цвета) инкубировали в аэробных условиях в течение 4 сут при 4°. Далее после центрифугирования в приведенных условиях и разбавления водой (1 : 20 об/об) фракцию еМох
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.