МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 1, с. 133-134
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ =
УДК 576.52:579.852.11.044
ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ОБРАТИМОЙ АДГЕЗИИ ТЕРМОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИИ BACILLUS LICHENIFORMIS 603
ОТ N-ЭТИЛМАЛЕИМИДА
© 2004 г. Т. Ä. Родионова*, Ю. Ä. Николаев**
^Ярославский государственный университет **Институт микробиологии РАН, Москва Поступила в редакцию 28.04.03 г.
Ранее нами было показано, что для термофильной бактерии Bacillus licheniformis так же как и для некоторых других бактерий свойственна выраженная способность к обратимой адгезии (OA), которая проявлялась как временное снижение количества клеток в жидкой культуре сразу после их инокулирования в свежую среду [1, 2]. OA минимальна в благоприятных условиях и выражена в неоптимальных для роста данных микроорганизмов условиях. Полученные результаты указывали на адаптивный характер OA, что имеет существенное значение для выживания популяции. В настоящей работе мы показали в прямом эксперименте, что OA защищает клетки B. licheniformis от неблагоприятных воздействий, в частности при их обработке окислителем SH-групп, N-этил-малеимидом (NEM).
Объектом исследований был штамм Bacillus licheniformis 603, выделеный из геодезической во-додобывающей скважины. Методы культивирования бактерий и определения величины обратимой адгезии (OA), а также состав питательных сред М9 и LB подробно описаны ранее [1-3].
Бактерий выращивали при 45°С на среде М9 до фазы экспоненциального роста, что соответствовало On540 = 0.3-0.5 (Specol (Carl Zeiss, Jena)). Затем клетки отмывали свежей средой М9 на фильтре (Millipore, 0.45 мкм) от культуральной жидкости, ресуспендировали в среде М9 до On = 0.1 и инкубировали в новой колбе в течение 20 мин при температуре 30°С. При этом On снижалась на 7-15% от начального значения, что обусловлено адгезией клеток на стенках колбы [1, 2]. Таким образом культура разделялась на две "субпопуляции" - ад-гезированных и свободноплавающих клеток. Для их разделения жидкую фазу сливали в новую колбу, а в исходную, с оставшимися адгезированны-ми на стекле клетками, немедленно добавляли свежую стерильную среду М9. После этого к обеим культурам добавляли N-этилмалеимид (NEM) (Sigma, CffiA) до концентрации 200 мкМ и инкубировали в условиях описанных выше. Через 20 мин определяли количество жизнеспособных
клеток в культурах обеих субпопуляций высевом их аликвот в десятичных разведениях на плотные среды (LB). Перед высевом на плотные среды проводили десорбирование клеток с поверхности колбы обеих культур. Для этого в колбу с культурой вносил стерилизованные сухим жаром стеклянные шарики (d = 1-2 мм) и интенсивно встряхивали в течение 1 мин на качалке. Эта процедура также способствовала гомогенизации свободноплавающих клеток, агрегированных в неблагоприятных условиях (в присутствии яда). Oтсутст-вие агрегатов клеток было необходимым условием для последующего адекватного определения числа жизнеспособных клеток высевом на плотные среды LB. Качество гомогенизации проверяли микроскопически (Docuval, Carl Zeiss, Jena).
Результаты воздействия NEM на жизнеспособность клеток бактерий представлены на рисунке. Воздействие NEM приводило к гибели большей части популяции (более 97%). Мы специально добивались такой высокой смертности клеток, так как ранее было показано, что факторы адаптации проявляют свое действие тем эффективнее, чем более подавлены бактерии [4]. При обработке NEM доля выживших клеток среди адгезиро-ванных была в 10 раз выше по сравнению с этим показателем для свободноплавающих клеток, (10% среди адгезированных и 1% среди свободноплавающих) (рисунок). В результате воздействия структура популяции меняется: до воздействия стрессорного фактора 90% клеток находилось в свободноплавающем состоянии, после его действия количество жизнеспособных клеток в жидкой среде и адгезированных на поверхности стало одинаковым.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что обратимое прикрепление к твердой поверхности обеспечивает защиту клеток бактерий от ядов.
Приведенный в настоящей работе сравнительный анализ устойчивости к NEM клеток бацилл, находящихся в свободном и прикрепленном состоянии, подтверждает недавно полученные дан-
134
РОДИОНОВА, НИКОЛАЕВ
Количество жизнеспособных клеток (КОЕ, % от 100% в исходной популяции)
102г 93
101
100
10-
0.9
0.8
Исходно
После обработки NEM
Защитное действие адгезии клеток Bacillus lichenifor-mis 603 при воздействии N-этилмалеимида, выраженное как численность колониеобразующих единиц (КОЕ) в % от их общего количества в популяции. 1 -свободноплавающие клетки, 2 - адгезированные клетки.
ные об адаптивном характере обратимой адгезии
[1] и общепринятое мнение о защитном характере адгезии вообще. Прикрепленное состояние клеток обеспечивает им такие несомненные преимущества (перед свободным состоянием) как большую концентрацию питательных веществ, адсорбированных на той же поверхности, защиту от возможного высыхания, вымывания потоком жидкости; действия токсичных ферментов; большую возможность коллективных действий, опосредованных внеклеточными метаболитами [5-8]. Результаты нашей работы позволяют включить в этот
перечень повышенную устойчивость к биоцидам химической природы.
Механизмы защитного действия прикрепления исследованы недостаточно. Одной из причин может быть то, что в адгезированном состоянии доступ яда к поверхности клетки затруднен вследствие экранирования одной ее стороны поверхностью. Не исключено, что прикрепление клетки индуцирует генерализованные изменения конформа-ции мембранных структур, что влияет на их устойчивость и функциональную активность [9].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Родионова Т.А., Шеховцова Н.В., Паников Н.С, Николаев Ю.А. Рост и адгезия Bacillus licheniformis 603 в зависимости от условий культивирования // Микробиология. 2003 (принята).
2. Николаев Ю.А, Проссер Дж.И. Внеклеточные факторы, влияющие на адгезию Pseudomonas fluo-rescens на стекле // Микробиология, 2000. Т. 69. № 2. С. 231-236.
3. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. V. 3.
4. Николаев Ю.А. Защитное влияние тетрациклин-чувствительного штамма Escherichia coli на рост тетрациклин-устойчивого штамма в присутствии тетрациклина при совместном культивировании.// Микробиология 1996. Т. 65. Вып. 6. С. 759-763.
5. Fletcher M. Effect of solid surfaces on the activity of attached bacteria // Bacterial adhesion (mechanisms and significance) / Eds. Savage D.C. and Fletcher M. New York, London: Press Plenum, 1985. P. 339-362.
6. Fletcher M. Bacterial attachments in aquatic environments: a diversity of surfaces and adhesion strategies // Bacterial adhesion (Molecular and ecological diversity). New York: Wiley-Liss, 1996. P. 1-24.
7. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. М.: Изд-во МГУ, 1987.
8. Звягинцев Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями. М.: Изд-во МГУ, 1973.
9. Конев С В. Структурная лабильность мембран и регулятор ные процессы. М.: Наука и техника, 1987. 240 с.
7
1
2
1
2
МИКРОБИОЛОГИЯ том 73 < 1 2004
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.