ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.143.6
ЗАВИСИМОСТЬ КАЛЛУСООБРАЗОВАНИЯ И ОРГАНОГЕНЕЗА ПОБЕГОВ ТОМАТА (Solanum lycopersicum L.) in vitro ОТ ГЕНОТИПА, ТИПА ЭКСПЛАНТА И СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ
© 2014 г. M. Р. Халилуев*, **, Л. Р. Богоутдинова*, **, Г. Б. Баранова*, Е. Н. Баранова*, П. Н. Харченко*, С. В. Долгов*, ***
*ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, 127550 Москва, ул. Тимирязевская, 42 **Российский государственный аграрный университет — МСХА им. К.А. Тимирязева, 127550Москва, ул. Тимирязевская, 49 ***Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290 Пущино, просп. Науки, 6 E-mail:marat131084@rambler.ru Поступила в редакцию 05.11.2013 г.
Исследовано влияние типа экспланта, а также вида и концентрации регуляторов роста на индукцию процессов каллусообразования и соматического органогенеза побегов in vitro четырех генотипов томата российской селекции. Проведено цитологическое изучение каллусной ткани. Установлено, что сорта томата обладают существенно большей способностью к непрямому органогенезу побегов по сравнению с гибридом F1. Для большинства исследуемых генотипов наибольшая частота соматического органогенеза побегов, а также их число на один эксплант были отмечены при культивировании семядольных листьев на питательной среде Мурасиге—Скуга, содержащей 2 мг/л зеатина в сочетании с 0.1 мг/л 3-индолилуксусной кислоты. Разработана эффективная методика непрямого соматического органогенеза побегов из различных эксплантов сортов томата с частотой >80%.
DOI: 10.7868/S0002332914060046
Томат — важнейшая сельскохозяйственная культура, занимающая первое место в мире среди продукции овощеводства по своему значению и объему производства, а также второе место после цитрусовых культур по витаминной ценности. Мировой валовой сбор товарной продукции томатов в 2012 г. составил 161.8 млн т, из которых на долю России приходится ~2.5 млн т (~1.5%) при возделывании на площади 117.7 тыс. га (FAO, 2014). Томат широко применяется в качестве модельного объекта в различных фундаментальных, а также прикладных исследованиях, например при получении гаплоидных и трансгенных растений, основанных на использовании метода культуры клеток и тканей in vitro.
Одно из основных условий применения метода культивирования изолированных органов, тканей и клеток томата in vitro — наличие высокоэффективной методики получения полноценных фертильных регенерантов. Регенерация побегов томата из соматических клеток наиболее часто достигается путем органогенеза с предшествующей стадией формирования каллусной ткани (Bhatia et al., 2004; Jabeen et al., 2005; Rashid, Bal, 2010). Другие способы, такие как прямой органогенез побегов или соматический эмбриогенез, применяются значительно реже (Newman et al., 1996; Chandel, Katiyar, 2000).
Морфогенез в культуре ткани — сложный процесс, регуляция которого осуществляется на клеточном, тканевом и организменном уровнях (Бу-тенко, 1999). На реализацию морфогенетическо-го потенциала соматических клеток существенно влияют генотип, физиологический возраст и происхождение экспланта, количественный и качественный состав регуляторов роста растений, условия культивирования и многие другие факторы (Gubis et al., 2003; Ashakiran et al, 2011; Zhang et al., 2012).
Установлено, что способность различных соматических тканей к морфогенезу in vitro находится под генетическим контролем. Ранее это было показано для многих видов растений, включая представителей семейства Solanaceae (Ежова, 2003; Trujillo-Moya et al., 2011). Известно, что дикие виды Solanum обладают более высокой реге-нерационной способностью, чем культурный томат (Lech et al., 1996). При этом частота органогенеза побегов у промышленных сортов и селекционных линий томата, используемых для получения гибридов F1, как правило, существенно ниже таковой у модельных генотипов, которые не представляют хозяйственно ценной значимости и не используются в селекционном процессе (Lima et al., 2004). К настоящему времени разработаны протоколы органогенеза побегов для ряда
зарубежных сортов и линий томата с различной частотой регенерации. В качестве эксплантов были использованы семядоли (Bhatia, Ashwath, 2008; Zhang et al., 2012), сегменты эпикотиля (Gubis et al., 2003), гипокотиля (Shahriari et al., 2006; Rashid, Bal, 2010), стебля (Harish et al., 2010) и цветоносов (Compton, Veilleux, 1991), фрагменты листьев (Chandel, Katiyar, 2000; Afroz et al., 2009), меристемы (Mirghis et al., 1995), а также протопласты (Gleddie et al., 1989) и незрелые зародыши (Young et al., 1987). Для индукции процессов кал-лусогенеза и регенерации побегов экспланты культивировали на питательных средах с широким диапазоном концентраций и видов цитоки-нинов (6-бензиламинопурина (6-БАП), зеатина, кинетина, 2-изопентениладенина или тидиазуро-на) в сочетании с низкими концентрациями ауксинов (3-индолилуксусной (ИУК), 1-нафтилук-сусной или 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислот) или без них (Bhatia et al., 2004; Халилуев и др., 2010; Osman et al., 2010).
Следует учитывать, что в процессе генетической трансформации морфогенетический потенциал культивируемых тканей существенно снижается. Причины этого — непосредственное заражение патогенным микроорганизмом (в случае агробактериальной трансформации) или механическое повреждение растительной ткани (в случае баллистической трансформации), ингибиру-ющее действие селективного агента, длительное культивирование в условиях in vitro, а также ряд других стрессовых факторов. В связи с этим необходимы исследования регенерационной способности конкретного генотипа и типа экспланта, а также подбор условий культивирования, обеспечивающих выход наибольшего количества реге-нерантов, главный из которых — состав питательной среды.
Цель исследования — изучение влияния генотипа томата, типа экспланта, вида и концентрации регуляторов роста, входящих в состав питательной среды, на процессы морфогенеза in vitro, а также разработка эффективной методики органогенеза побегов томата на основе промышленных генотипов российской селекции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительным материалом для исследований служили семена коммерческих сортов томата Рекордсмен, Праздничный и Транс новинка селекции ВНИИ орошаемого овощеводства и бахчеводства РАСХН (Астраханская обл.), а также гибрид Б1 Черныш, оригинатор которого Мичуринский государственный аграрный университет (Тамбовская обл.).
Для получения донорных растений томата использовали семена, которые подвергали поверх-
Таблица 1. Вид и концентрация регуляторов роста, входящих в состав питательной среды, для индукции процессов каллусообразования и органогенеза побегов томата
Регулятор
Концентрация регуляторов роста, мг/л
роста MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7
Зеатин 1 1 2 - - 1
6-БАП - - - 2 4 2
ИУК 0.1 0.5 0.1 0.1 0.1 0.1
Примечание. 6-БАП — 6-бензиламинопурин, ИУК — 3-ин-долилуксусная кислота; "—" — отсутствие компонента, для табл. 1—4.
ностной стерилизации в течение 10 с в 96%-ном этаноле, а затем в течение 7—8 мин в 20%-ном водном растворе хлорсодержащего коммерческого отбеливателя АСЕ с добавлением нескольких капель детергента Tween 20. После стерилизации семена 3—4 раза промывали стерильной дистиллированной водой и помещали в культуральные сосуды с питательной средой, основанной на минеральных компонентах с витаминами, составленной по прописи Мурасиге—Скуга (MS) (Mu-rashige, Skoog, 1962) и дополненной 3%-ной сахарозой и 0.7%-ным агаром.
В качестве эксплантов использовали семядоли, включая черешки длиной 2—3 мм, а также сегменты гипокотилей размером 10—15 мм, полученные из средней части 10-12-суточных асептических проростков. Для индукции процессов морфогенеза экспланты культивировали на ага-ризованной питательной среде указанного состава, не содержащей регуляторов роста (MS1), а также на средах c добавлением различных концентраций зеатина (Sigma, США) и 6-БАП (Sigma) в сочетании с ИУК (Sigma) (MS2—MS7) (табл. 1). Каждый опытный вариант состоял из четырех по-вторностей по 10 эксплантов.
Перед автоклавированием рН питательных сред доводили 1 M КОН до 5.7—5.8. Стерилизацию питательной среды осуществляли автоклавированием в течение 20 мин при 121°С и давлении 1.1 атм. Регуляторы роста стерилизовали пропусканием через нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0.22 мкм (Millipore, США) и добавляли после автоклавирования в охлажденную до 45°С среду. Экспланты гипокотилей и семядолей помещали на поверхность питательной среды соответственно горизонтально и абаксиальной стороной. Субкультивирование на свежую питательную среду проводили через каждые 15 сут. Культивирование донорных растений и эксплантов осуществляли в световой комнате со следующими условиями: температура 23—25°С, освещенность 2.5—3.0 клк, фотопериод 16/8 ч (день/ночь).
Оценку эффективности процессов морфогенеза проводили после 45 сут культивирования по следующим показателям: частоте каллусообразо-вания, частоте органогенеза побегов и среднему числу побегов на одном экспланте. Частоту кал-лусообразования, выраженную в процентах, определяли как отношение числа эксплантов, образовавших каллусную ткань, к их общему числу. Частоту органогенеза побегов, выраженную в процентах, определяли как отношение числа экс-плантов, у которых происходил органогенез побегов, к общему числу эксплантов, сформировавших каллус. Среднее число побегов на одном экс-планте определяли как отношение числа регенерантов к общему числу эксплантов, у которых наблюдался органогенез побегов.
Для световой микроскопии фрагменты эксплантов семядолей и гипокотилей, а также каллу-сную ткань фиксировали в 2.5%-ном растворе глутарового альдегида (Merck, Германия) на 0.1 М фосфатном буфере Серенсена (рН 7.2) с добавлением 1.5% сахарозы. После отмывки от фиксирующей смеси растительный материал дофиксиро-вали 1%-ным раствором четырехокиси осмия (0s04) (Sigma), обезвоживали в этаноле повышающейся концентрации (30, 50, 70, 96 и 100%), затем в окиси пропилена (Fluka, Германия) и заключали в смесь эпоксидных смол Эпона-812 и Аралдита (Merck) по стандартной методике (Уикли, 1975).
Полу
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.