МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 6, с. 751-757
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.282.23.017.732:577.121.3
ЗАВИСИМОСТЬ СИНТЕЗА АСТАКСАНТИНА У ДРОЖЖЕЙ
рнлтл ЯНОВОХУМА ОТ интенсивности
АНАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
© 2004 г. М. М. Вустин1, Е. Н. Белых, С. А. Кишилова
ВГУП Гос НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва
Поступила в редакцию 11.02.03 г.
Показано, что синтез астаксантина у дрожжей РНа£г1а тНойогута находится в зависимости от интенсивности скорости роста в первые двое суток культивирования. Скорость роста исследуемой культуры дрожжей целенаправленно задавали условиями культивирования, определяющими среди которых было соотношение С : N. Интенсивный анаболический процесс, сопряженный с активным ростом культуры в первые сутки, сильно подавлял синтез ключевых ферментов, участвующих в синтезе астаксантина, что приводило к заметному снижению продукции каротиноида. Продемонстрировано, что для получения максимального съема астаксантина с 1 л питательной среды необходимо вести культивирование, начиная с первых суток со скоростью значительно меньшей, чем Цщ^. Определена оптимальная скорость почкования мутантного штамма дрожжей РН. тНойогута ВКЙМ У-2409, соответствующая условиям максимального синтеза астаксантина. При скорости почкования <0.5 удельная продуктивность по астаксантину у исследуемого штамма составляла около 7.0 мг/г сухой биомассы.
Ключевые слова: астаксантин, РНа$'1а тНойогута, синтез каротиноидов, интенсивность анаболизма.
Астаксантин (AX) - довольно широко распост-раненный в природе пигмент каротиноидной природы. Он может быть выделен из цветков некоторых растений, морских микроорганизмов и животных, водорослей и лишайников, а также из дрожжевых грибов Phaffia rhodozyma [1]. Способность ряда животных, таких как птицы, рыбы и ракообразные аккумулировать астаксантин в своих тканях, послужило причиной активного изучения дрожжей Ph. rhodozyma как природного источника этого пигмента. Астаксантин активно применяется в сельском хозяйстве в качестве примекса в комбикормах для кур [2, 3] и радужной форели при иску-ственном ее разведении [4]. Добавление астаксантина приводит к окрашиванию мышечных тканей форели и желтков яиц кур в интенсивно красный цвет, что значительно повышает конкурентноспособность этих товаров на рынке.
Особенности синтеза астаксантина, как и других каротиноидов, находятся в прямой зависимости от факторов внешней среды. Ярко выраженные антиоксидантные свойства АХ, обусловленные его химическим строением, способствуют выживанию отдельных групп микроорганизмов, синтезирующих АХ, в неблагоприятных условиях. В первую очередь, это относится к способности таких микроорганизмов связывать свободные радикалы, возникающие в процессе их жизнедея-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: vkpm@vnigen. msk. ru).
тельности. АХ, обладая большим количеством активных двойных связей, очень эффективно может выступать в роли своеобразной ловушки этих радикалов, выполняя функцию их "гашения".
Влияние различных факторов культивирования на синтез астаксантина у РН. тНойо1ута достаточно широко освещалось в литературе [5-8], тем не менее остается много неясных вопросов, касающихся механизмов регуляции синтеза каротиноидов, включая АХ. Отмечено, что условия для оптимального роста биомассы и максимального синтеза астаксантина заметно различаются [9]. Источник углерода, как и его концентрация, в процессе роста культуры играют важную роль в синтезе АХ у дрожжей РН. тНойо1ута. Установлено, что синтез АХ подвержен глюкозной репрессии, поэтому начальная концентрация глюкозы, превышающая 5%, заметно ингибирует синтез АХ [8]. Уровень АХ значительно увеличивается по сравнению с контролем, если культивирование вести при лимите по источнику углерода [9]. Соответственно высокие уровни источника углерода в среде, особенно в лаг-фазе и ранней фазе экспоненциального роста, являются причиной уменьшения синтеза АХ и увеличения синтеза таких побочных продуктов, как этиловый спирт и ацетальдегид. Культивирование дрожжей в условиях глубокого лимита по азоту в стадии логарифмического роста в дальнейшем резко снижало содержание АХ в биомассе дрожжей
РН. гНо^1ута [9]. При высоких соотношениях С : N (углерода к азоту) наблюдалось значительное увеличение синтеза как липидов, так и каротино-идов в клетках данных дрожжей. Авторами отмечено, что у суперпродуцентов АХ утилизация азота идет гораздо медленнее, чем у диких штаммов, что может указывать на возможность азотной регуляции биосинтеза АХ. Опыты в проточных культурах показали, что оптимальными условиями для синтеза АХ следует считать неглубокий лимит по источнику углерода в процессе всего культивирования [10, 11].
В настоящей работе сделана попытка выявить некоторые закономерности между интенсивностью анаболических процессов культуры, находящейся в логарифмической фазе роста, и синтезом основных каротиноидов, накапливаемых дрожжами РН. тНойо1ута. Следует отметить, что влияние таких ключевых для синтеза АХ факторов, как свет и аэрация мы не рассматривали и все опыты проводили в оптимальных по этим параметрам условиях. Основное внимание было уделено условиям синтеза ферментных систем, определяющих в стационарной фазе синтез доминирующих каротиноидов, наиболее важным из которых является АХ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали мутантный штамм дрожжей РНа$~1а тНойо1ута ВКПм У-2409 со снятой катаболитной репрессией, способный накапливать до 10 мг каротиноидов (сумма пигментов) на 1 г сухой биомассы. Выбор штамма для работы не был случайным, так как высокий уровень синтеза АХ у этого мутанта дает возможность более детального изучения влияния основных факторов культивирования на синтез АХ. С другой стороны, выбирая данный штамм, мы понимали, что не все выявленные закономерности могут быть отнесены ко всем дрожжам РН. тНойо1ута. В первую очередь, это можно отнести к способности данного мутантного штамма хорошо расти и синтезировать каротиноиды при достаточно высоких концентрациях глюкозы в среде (>10%). Дрожжи культивировали на среде, содержащей глюкозу, пептон, соли (г/л): КН2Р04 - 1.0, М§Б04 - 0.5, №С1 -0.1, СаС12 - 0.1; витамины (мкг/л): биотин - 50; тиамин - 500; пантотенат Са - 2000; фолиевая кислота - 2; инозитол - 1000; никотиновая кислота - 400; парааминобензойная кислота - 200; пиридоксин гидрохлорид - 400; рибофлавин -200; микроэлементы (мкг/л): борная кислота -500; Си804 - 40; К1 - 100; РеС13 - 200; Ми804 - 400; №2Мо04 - 200; 2и804 - 400. Начальная концентрация глюкозы в средах была постоянной во всех опытах и оптимальной для синтеза астаксантина у исследуемого штамма при культивировании в колбах - 20%. При неизменном содержании глюко-
зы варьировали количество азота (пептона) в среде. Содержание аминного азота в 1%-ном растворе используемого пептона составляло 0.18 мг/мл. Количество глюкозы и источника азота пересчитывали на содержание углерода и азота соответственно и выражали как соотношение С : N. Дрожжи выращивали на круговой качалке (250 об/мин) в колбах на 750 мл и в 3-литровых ферментерах фирмы "Anglicon" при температуре 17°C при постоянном освещении (60 лк) в течение 7 сут, рН 5.0 в ферметерах поддерживали раствором KOH. Если было необходимо, использовали 50%-ный раствор глюкозы в качестве подпитки. Ингибитор белкового синтеза циклогексимид (ЦГМ), добавляли в питательную среду в концентрации 0.05% в/об, которая фактически полностью подавляла синтез белков и, соответственно, рост культуры дрожжей данного вида [12]. Контроль за полным прекращением трансляции белка для исследуемого штамма осуществляли с использованием меченого по [14С]лейцина.
ЦГМ в указанной выше концентрации добавляли в культуру определенной (заданной) фазы роста. Параллельно в культуры с ЦГМ и без ЦГМ (контрольную) добавляли меченый [14С]лейцин в концентрации 0.5 мкКю. Пробы отбирали каждые 20 мин, биомассу собирали на фильтре фирмы "Millipore", трижды промывали дистиллированной водой, высушивали при 60°C и измеряли в ней радиоактивность на приборе "Delta 300". Массу сухих клеток (г/л) в анализируемых пробах определяли после их высушивания на лиофильной сушке. Титр клеток определяли их подсчетом в камере Горяева, при этом все еще не отделившиеся от материнской клетки почки считали как независимые клетки. Удельную скорость почкования определяли как разность титров клеток за 1 ч. Интенсивность роста культуры исследуемых дрожжей определяли как способность накапливать сухую биомассу в единицу времени и выражали в г/ч. Каротиноиды из биомассы экстрагировали ацетоном при одновременном разрушении клеток стеклянными бусами фирмы "Sigma" (425-600 мкм) на шейкере [13]. Сумму каротиноидов определяли по общепринятой методике [8] с использованием спектрофотометра Shimadzu UV-120. Измерения проводили в кварцевых кюветах при X = 474 нм, что соответсвовало максимуму поглощения астаксантина в петролейном эфире. Максимум поглощения АХ в ацетоне находится в этом же интервале (471-477 нм), поэтому удельную продуктивность штаммов расчитывали по формуле, в которой использовали данные коэффициента экстинкции астаксантина в петролей-ном эфире:
C =
VA474 х 100
21 m
30 25 20 15 10 5
□ Сухая биомасса
□ Сумма каротиноидов
LL
40 20 10 5 3 1.5 Соотношение С : N
Рис. 1. Влияние соотношения С : N 1 - на рост биомассы (г/л) и 2 - на накопление каротиноидов (мг/л).
Каротиноиды, мг/г 12
10 8642
□ 1 □ 2
□ 3
□ 4
20 10 5 3 Соотношение C : N
Рис. 2. Зависимость состава основных каротиноидов от соотношения С : N: 1 - сумма каротиноидов; 2 - ас-таксантин; 3 - бета-каротин; 4 - фоеникоксантин.
1
2
0
где, C - сумма каротиноидов в 1 г сухой биомассы, V - объем ацетона, А474 - показания спектрофотометра, m - навеска биомассы сухих дрожжей, 2.100 - коэффициент экстинкции 1%-ного астак-сантина. Процентное соотношение каротиноидов определяли с использованием жидкостной хрома-тографической системы HPLC (колонка С-18). В качестве стандартов использовали чистые кристаллические препараты астаксантина (АХ) и Р-ка-ротина фирмы "Sigma". Все опыты ставили в пятикратной повторности при не менее
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.