БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 6, с. 785 - 797
УДК 577.355.2
ЗЕЛЕНАЯ ВОДОРОСЛЬ Chlamydomonas reinhardtii КАК МОДЕЛЬНЫЙ ОРГАНИЗМ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ДЕЙСТВИЯ МУТАЦИЙ В БЕЛКЕ PsbO ФОТОСИСТЕМЫ II in vivo
Обзор
© 2015 А.В. Пиголев*, В.В. Климов
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290Пущино Московской обл.; факс: +7(496)733-0532, электронная почта: alexey-pigolev@rambler.ru
Поступила в редакцию 12.01.15 После доработки 25.02.15
Окисление воды в фотосистеме 2 (ФС-2) происходит в специальном водоокисляющем комплексе (ВОК). В его состав входит каталитический центр — Мп4Са05-кластер, важное значение в стабилизации которого принадлежит внешним белкам ВОК. Главным среди этих белков является белок PsbO, который связывается с ФС-2 вблизи Mn-кластера и напрямую участвует в регуляции его стабильности и активности. Однако молекулярный механизм, с помощью которого PsbO вовлечен в процесс фотосинтетического окисления воды, до сих пор остается невыясненным. Один из подходов в решении данной проблемы — применение сайт-направленного мутагенеза. Для изучения эффекта направленных мутаций в PsbO in vivo вплоть до недавнего времени были использованы только цианобактерии (прокариотические организмы). На эукариотичес-ких организмах такие исследования (сайт-направленный мутагенез PsbO) не проводили, в то же время известно, что у растений и цианобактерий роль белка PsbO может отличаться. В обзоре рассмотрена возможность использования для этой цели одноклеточную зеленую водоросль Chlamydomonas reinhardtii — эукари-ота, со сходным с высшими растениями составом белков ВОК. Однако, в отличие от высших растений, штамм ApsbO С. reinhardtii жизнеспособен, а при выращивании в темноте (гетеротрофно) в нем собирается базовый комплекс ФС-2, обладающий фотохимической активностью, что позволяет исследовать роль отдельных аминокислотных остатков в PsbO in vivo без повреждений ФС-2 вследствие фотоинактивации.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фотосистема 2, водоокисляющий комплекс, белок PsbO, Chlamydomonas reinhardtii, сайт-направленный мутагенез.
Фотосистема 2 (ФС-2) — единственный в природе фермент, способный окислять воду за счет энергии поглощенного света, что позволяет растениям и цианобактериям использовать ее в качестве донора электронов при фотосинтезе. Чтобы отнять электроны у молекулы воды (Е0' = 0,81 В), ФС-2 генерирует самый сильный биологический окислитель — катион-радикал хлорофилла Р680+' с редокс-потенциалом, равным 1,12—1,26 В
Принятые сокращения: ФС-2 — фотосистема 2; МСБ — марганец-стабилизирующий белок (РвЪО); крзЬО — мутант с инактивированным геном, кодирующим белок РвЪО; ВОК — водоокисляющий комплекс; РЦ — фотохимический реакционный центр; ЭТЦ — электрон-транспортная цепь; Fv/Fm — отношение переменной флуоресценции хлорофилла (Д) к максимальному уровню флуоресценции Дт; Д' и Дт — изменения выхода флуоресценции на фоне действия постоянного света; ТМФД — тетраметил-р-фе-нилендиамин.
* Адресат для корреспонденции.
[1—4]. Однако сам хлорофилл P680+' воду не окисляет. Окисление происходит в расположенном рядом с P680+ водоокисляющем комплексе (ВОК) ФС-2, в каталитический центр которого входит четыре атома марганца и один атом кальция (Мп4СаО5-кластер).
Лигандами атомов марганца и кальция являются белки D1 и CP43 [5], которые вместе с белками D2, CP47, цитохромом b559 и PsbI формируют минимальный комплекс ФС-2, способный окислять воду в условиях in vitro. Однако подобный комплекс не стабилен и быстро инактиви-руется. Для его устойчивой работы необходимо присутствие еще нескольких внешних белков ВОК, связанных с донорной стороной ФС-2 [6—7]. У высших растений и зеленых водорослей такими белками являются PsbO, PsbP, PsbQ и PsbR (у цианобактерий — PsbO, PsbU и PsbV), основная функция которых вероятно заключается в регуляции и стабилизации работы водо-
окисляющего комплекса. Центральную роль в этом играет белок PsbO, который непосредственно влияет на стабильность Mn- кластера [7—8]. Так, удаление белка PsbO из препаратов фотосистемы 2 приводит к 80%-ному снижению скорости фотосинтетического выделения кислорода и к постепенному выходу в среду двух из четырех атомов марганца, входящих в состав ВОК [9].
Для объяснения функции PsbO было предложено несколько гипотез. Наиболее распространенная гипотеза состоит в том, что белок PsbO необходим для защиты Mn-кластера. Согласно этим представлениям, PsbO связывается с ВОК ФС-2 со стороны люмена и закрывает (защищает) каталитический центр от активных химических соединений (восстановителей, металлов, ионов OH- и пр.) [8, 10]. Предполагается также, что PsbO может участвовать в организации протонно-водного транспорта между ВОК и люменом [6-8]. Тем не менее, несмотря на длительный срок исследований (с 1979 г.), действительная функциональная роль белка PsbO в процессе фотосинтетического окисления воды остается невыясненной. Особенно, если нужно указать конкретные аминокислоты в последовательности белка, ответственные за предполагаемую функцию [8, 10-11].
Один из возможных путей решения обозначенной проблемы - это применение сайт-направленного мутагенеза. Важным этапом в этой работе является выбор объекта для исследования. Поскольку PsbO является одним из немногих гидрофильных белков в составе ФС-2, то для его изучения чаще всего используют метод мутаций in vitro (препараты ФС-2) [10, 12]. Однако в этих условиях невозможно изучить влияние мутации на биогенез ФС-2, что является одним из самых интересных направлений исследований процесса фотосинтеза в последнее время. Ответить на эти вопросы можно только на живых организмах, изучая эффект аминокислотных замен in vivo.
До последнего времени единственным объектом таких манипуляций были цианобактерии (прокариоты) [13-14]. Однако, из-за значительных отличий в составе внешних белков ВОК между растениями и цианобактериями, а также вследствие того, что функции PsbO у этих организмов могут незначительно, но отличаться, переносить получаемые результаты на растения не совсем корректно. Поэтому особый интерес представляет работа c эукариотическими организмами со сходным белковым составом.
Работать непосредственно с высшими растениями сложно по многим причинам. Главная проблема заключается в том, что ApsbO-мутант
(с инактивированным геном, кодирующим белок PsbO) у них не жизнеспособен [15]. Кроме того, использованию высших растений препятствует то, что мутации в PsbO делают ФС-2 неустойчивой к фотоинактивации. Поэтому более подходящим для исследования организмом может стать одноклеточная зеленая водоросль Chlamy-domonas reinhardtii, поскольку этот эука-риотический организм имеет состав белков ВОК, сходный с таковым у высших растений. Помимо этого, C. reinhardtii обладает уникальным метаболизмом для зеленых растений. В отличие от высших растений, которым для роста нужен свет (облигатные фототрофы), C. reinhardtii может расти в темноте (гетеротрофно) на ацетате и в то же время формировать зеленый активный хлоропласт [16—17]. Эта особенность C. reinhardtii позволяет изучать функциональное состояние и биогенез комплекса ФС-2 in vivo, исключая повреждение ВОК в результате фотоинактивации.
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ФОТОСИСТЕМЫ 2
В настоящее время детали строения ФС-2 хорошо известны благодаря данным рентгеност-руктурного анализа ФС-2 цианобактерий с разрешением до 1,9 А в последней работе Умены и со-авт. в 2011 г. [5]. Согласно данным этой работы, ФС-2 в клетках цианобактерий (и эукариот) представлена в основном в виде димерного комплекса с мол. массой ~700 кДа, каждый мономер которого состоит из 20 белков и связанных с ними молекул пигментов, липидов и кофакторов переноса электронов (рис. 1, см. цветную вклейку). Большая часть этих белков (17) встроена в мембрану и содержит от одной до шести трансмембранных спиралей и лишь три белка являются периферийными (Р8ЪО, Р8ЪУ, Р8Ъи) [5, 18].
Условно все белки ФС-2 можно разделить на три группы: 1) белки т.н. ядра ФС-2 и группы примыкающих к ним низкомолекулярных белков; 2) водорастворимые белки водоокисляю-щего комплекса и 3) белки внешней антенны комплекса.
Ключевыми для работы ФС-2 являются два белка ядра ФС-2 — и Б2, с которыми связаны все основные кофакторы переноса электронов, среди которых: 1) шесть молекул хлорофилла а, две из которых входят в состав реакционного центра (РЦ), образуя димер с максимумом поглощения 680 нм (Р680), который является первичным донором электрона и передает свой электрон при возбуждении на молекулу
феофитина; 2) две молекулы феофитина (безмагниевого производного хлорофилла), только одна из которых (связанная с белком Б1) служит промежуточным акцептором электрона; 3) два хинона — пластохинон рА (связанный с белком Б2) и пластохинон рв (связанный с белком Б1), вторичный и конечный акцепторы электрона в ФС-2, расположенные на стромальной стороне ФС-2; 4) TyrZ (остаток тирозина 161 белка Б1) и Мп4СаО5-кластер, образующие редокс-систему окисления воды (у одного из марганцев лиган-дом также является белок СР43) [4—5, 19].
Все вместе они формируют цепь переносчиков электронов, которая располагается в следующем порядке в направлении от люмена к строме:
Н2О ^ ВОК [Мп4СаО5] ^
^ Yz/Y| ^ Р680/Р+80 ^
^ Pheo a/Pheo а- ^ Р^а ^ РВ/РВ.
В основе механизма функционирования ФС-2 лежат окислительно-восстановительные реакции: ФС-2 с помощью света окисляет воду и переносит электроны на пул пластохинонов. В центре этого процесса находится индуцируемое светом разделение зарядов в РЦ, в результате которого на донорной стороне ФС-2 возникает самый сильный биологический окислитель Р680+ с редокс-потенциалом до +1,26 В [1-2]. Дефицит электрона в нем восполняется за счет электронов, полученных при окислении воды. Для этого в составе ФС-2 есть специальный во-доокисляющий комплекс, каталитический центр которого содержит ионы марганца (Мп-кластер). Мп-кластер представляет собой ре-докс-систему, способную последовательно отдавать четыре электрона акцептору (Ту^) и затем забирать их у донора (2Н2О) [20].
Мп-кластер последовательно, после каждой вспышки света, окисляется, проходя через пять промежуточных сос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.