БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 5, с. 363-369
УДК 577.333
ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ ЛИПИДОВ ВАКУОЛЕЙ КОРНЕПЛОДОВ РАСТЕНИЙ
© 2007 г. С. П. Макаренко, Т. А. Коненкина, Л. В. Дударева
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132, тел. (3952) 42-67-21 факс: (3952) 51-07-54; электронная почта: matmod@sifibr.irk.ru Поступила в редакцию 05.02.2007 г.
С помощью ГЖХ изучен жирнокислотный состав липидов вакуолей из запасающих тканей зонтичных растений (пастернака, петрушки и моркови) и рассмотрены возможные пути их биосинтеза. Отмечается высокий уровень ненасыщенных жирных кислот (до 78% от суммы жирных кислот) с преобладанием линолевой кислоты, содержание которой составляет в липидах вакуолей пастернака, петрушки и моркови 53.5, 55.1 и 54.9% соответственно. В составе липидов вакуолей петрушки и пастернака установлено высокое содержание гексадекадиеновой С16:2ю6 кислоты (8.0 и 4.6% соответственно). Содержание а-линоленовой кислоты в липидах вакуолей этих растений составляет 4.8-7.3%. Из насыщенных жирных кислот в липидах вакуолей корнеплодов этих растений преобладает пальмитиновая кислота, содержание которой составляло 18.0-20.7%. Высокий уровень линолевой и гексадекадиеновой кислот в липидах вакуолей корнеплодов пастернака и петрушки может указывать на важную роль гена fad2 микросомальной жирнокислотной ю6-десатуразы в устойчивости и акклиматизации этих растений к низким температурам.
Исследование тонопласта и центральных вакуолей высших растений обусловлено двумя основными причинами: первая связана с выяснением роли тонопласта и вакуолей в структурной и функциональной организации клетки и целого организма, а вторая - возможностью их использования в области мембранной биологии для изучения фундаментальных проблем структуры, состава и функций биомембран [1-7]. Вакуоль в зрелой растительной клетке занимает >90% от общего клеточного объема, и большинство клеточных молекул секвестрируется в вакуолярном компартменте, который содержит вакуолярный сок, состоящий из концентрированного раствора солей, углеводов, белков и других метаболитов, и ограничен вакуолярной мембраной - тонопластом. Вакуолярная мембрана изолирует цитоплазму от кислого и гидролитически активного вакуолярного сока и служит, таким образом, барьером, предотвращающим утечку содержимого вакуолей, и имеет активно действующие механизмы переноса ряда соединений против градиента концентрации и электрохимической активности. Тонопластные белки принимают активное участие в транспорте различных соединений между цитоплазмой и вакуолью [1-3, 5, 6]. В вакуолях из суспензионной культуры Arabidopsis ЛаНапа протеомным анализом было идентифицировано 163 тонопластных белка, включая водные
Адрес для корреспонденции: Макаренко Сергей Петрович, 664033 г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132. СИФИБР СО РАН. Факс: (3952)510754; тел. (3952)425892; электронная почта: makar@sifibr.irk.ru.
каналы (тонопластные интегральные белки, или TIP), вакуолярную Н+-АТР-азу, вакуолярную H+-пирофосфатазу (V-PP-аза) и другие [7]. В изолированных вакуолях из протопластов листьев Arabi-dopsis thaliana с применением протеомной методологии было выделено и изучено 402 вакуолярных белка, которые были представлены транспортерами, гликозидазами, протеазами и другими [8]. Про-теазы центральных вакуолей растений довольно часто являются аналогами белков вакуолей дрожжей и лизосом животных [3, 4, 6]. Изучение архитектуры тонопласта и динамики осмотического стресса в вакуолях, полученных из суспензионной культуры табака, показало, что вакуолярная мембрана является сферической структурой, состоящей из липидных доменов, в которых концентрируются аквапорины - тонопластные интегральные белки, регулирующие проницаемость мембраны для воды и контролирующие водный поток из цитозоля в вакуоль и обратно [9]. Сферическая структура тонопласта может отображать не только уникальную текучесть и эластичность мембраны, но и специфичность жирнокислотного состава липидов бислоя, образованного из глицеролипидов с ненасыщенными жирными кислотами, преимущественно полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК), которые обеспечивают протекание осмотических процессов и регуляцию гомеостаза в растительной клетке [6, 10-13]. Высокое содержание липидов в тонопласте оказывает влияние не только на жидкостные свойства мембраны, но и на активность мембраносвязанных ферментов, таких как АТР-аза,
пирофосфатаза, липаза и др., а также на экспрессию рецепторов, мембранную проницаемость и транспортные свойства [14, 15]. Важная роль в этих процессах отводится десатуразам жирных кислот - ферментам, участвующим в биосинтезе ненасыщенных жирных кислот: ацил-АПБ (ацил-переносящий белок)-десатуразе жирных кислот, связанной с АПБ-16:0 и АПБ-18:0, и ацил-липид-ным десатуразам, различающимся по структуре и свойствам [16-19]. В пластидных мембранах растений первая двойная связь образуется растворимыми ацил-АПБ-десатуразами в цепях жирных кислот. Дальнейший синтез ненасыщенных жирных кислот в пластидах осуществляется нерастворимыми ацил-липидными мембранными ro6-(Fad6) и ro3-(Fad7, Fad8) десатуразами, участвующими в образовании второй и третьей двойной связи в цис-конфигурации. Например, в A. thaliana ген fad3 кодирует микросомальную ю3-десатуразу [20], тогда как гены fad7 и fad8 кодируют пластидные ю3-десатуразы [21]. В высших растениях гены fad3 и fad7 экспрессируются конститутивно при всех температурах, тогда как ген fad8 экспрессируется только при температуре ниже 20°С [22]. Следует отметить, что в клетках растений олеиновая кислота, связанная с АПБ, может транспортироваться как в мембраны хлоропластов, так и в эндоплазма-тический ретикулум для последующей десатура-ции в липид-связанной форме [18, 23]. В цитоплаз-матических мембранах высших растений синтез ПНЖК осуществляется ацил-липидными мембранными ro6-(Fad2) и ro3-(Fad3) десатуразами [17-19]. Ацил-липидные мембранные ю6- и ю3-де-сатуразы играют важную роль в устойчивости и акклиматизации растений к низким температурам [16, 17, 25]. Так, при изучении влияния температуры на рост и развитие растений, в бобах сои (Glycine max) были клонированы два родственных гена fad.2-1 и fad2-2, кодирующих две формы ю6-деса-туразы. При этом было показано, что микросо-мальная десатураза Fad2-1 интенсивно экспресси-ровалась только в созревающих семенах сои, тогда как десатураза Fad2-2 конститутивно экспресси-ровалась как в вегетативных тканях, так и в семенах. Ген fad2-1 в запасающих липидах семян сои контролирует конверсию олеиновой кислоты в ли-нолевую. Отмечено, что в семенах и тканях листьев сои содержание линолевой и а-линоленовой кислот увеличивалось с понижением температуры [24]. При изучении фосфолипидного состава и де-сатурации жирных кислот в плазмалемме из корней ржи было установлено, что акклиматизация растений при низких температурах приводит к увеличению содержания а-линоленовой кислоты в фосфатидилхолине (ФХ) и фосфатидилэтанол-амине (ФЭ) с 20 до 40%, тогда как содержание линолевой кислоты в этих же липидах, напротив, уменьшается с 50 до 30% [21]. Введение генаfad3 в культуру табака катализировало превращение
С18:2ю6 в С18:3ю3 и приводило, соответственно, к уменьшению уровня линолевой кислоты в ФХ и ФЭ плазмалеммы корней и увеличению содержания а-линоленовой кислоты в этих же липидах. При этом уменьшение температуры среды с 26 до 15°С не влияло на вязкость мембраны [21]. Многими авторами [22, 25] отмечается, что содержание триеновых жирных кислот в семенах и корневых тканях растений зависит главным образом от активности десатуразы Fad3, локализованной в эндо-плазматическом ретикулуме (ER), что приводит к увеличению уровня а-линоленовой кислоты и уменьшению уровня линолевой. Например, анализ жирнокислотного состава липидов в трансгенных тканях растений показал, что экспрессия ацил-ли-пидной ю3-жирнокислотной десатуразы приводила к более чем 10-кратному увеличению уровня а-линоленовой кислоты в липидах семян A. thaliana и корнях моркови (Daucus carota L.) [20].
Несмотря на изученность биохимических процессов, обеспечивающих адаптивные изменения липидного состава мембран отдельных видов культурных растений, таких как арабидопсис, табак, кукуруза, соя, рис и других, при действии низких температур, вопросы устойчивости и липидного метаболизма корнеплодов культурных растений при низких температурах мало изучены [26, 27]. В настоящей работе нами был исследован жирнокис-лотный состав липидов вакуолей, выделенных из запасающих тканей корнеплодов пастернака, петрушки и моркови, отличающихся различной устойчивостью к низким температурам, и рассмотрены возможные пути биосинтеза ненасыщенных жирных кислот в липидах вакуолярных мембран.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Объектом исследования служили вакуоли из запасающих тканей корнеплодов зонтичных растений: пастернака (Pastinaca sativa L.), петрушки (Petroselinium crispum L.), моркови (Daucus carota L.). Пастернак и петрушка, в отличие от моркови, характеризуются высокой зимостойкостью и морозоустойчивостью, способностью корнеплодов хорошо сохраняться в почве в зимний период, тогда как морковь способна выдерживать низкие температуры в пределах от 0 до -20°С. Вакуоли получали путем измельчения тканей корнеплодов в среде выделения 1 (0.8 М КС1, 20 мМ EDTA, 50 мМ Na2HPO4, pH 8.0) по описанной ранее методике, включающей механическое выделение вакуолей с помощью специального аппарата [26, 28]. Суспензию вакуолей отделяли от примесей различных органелл и остатков растительных тканей с помощью капроновой планктонной сетки (130 меш) и центрифугировали при 250 g в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали в среде выделения 2 (1.0 M KCl, 1 мМ EDTA, 5 мМ трис-HCl, pH 7.4) и центрифугировали вновь 10 мин при 50 g, выход вакуолей
составлял 107-108 вакуолей/кг ткани [28]. Липиды из вакуолей экстрагировали системой хлороформ -метанол - вода (1:2:0.8 v/v) [29]. Растворитель из экстракта липидов удаляли на роторном испарителе, остаток подвергали переметилированию по методу [30]. ГЖХ-анализ полученных метиловых эфиров жирных кислот (МЭ ЖК) проводи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.