найти ответ на этот вопрос предпринимались еще в 70-х гг. XX в. (Adams et al., 1976; Cavero et al., 1973, 1974; Li, 1980; Manno, Manno, 1973; Smiley et al., 1976; Volmer et al., 1974). Единственным "фармакологическим инструментом" для изучения СВ-рецепторов в те годы был Д9-ТНС (Adams et al., 1976; Cavero et al., 1973, 1974; Li, 1980; Manno, Manno, 1973; Smiley et al., 1976; Volmer et al., 1974). В ходе этих исследований было установлено, что наиболее типичными реакциями сердечно-сосудистой системы на внутривенное введение Д9-ТНС являются брадикардия, гипотенезия и снижение ударного объема (Adams et al., 1976; Cavero et al., 1973, 1974; Volmer et al., 1974). Однако некоторые аспекты влияния каннабиноидов на сердце до сих пор остаются неизученными. Например, при анализе данных литературы мы не встретили сведений о том, как влияют каннабино-иды на процессы реполяризации в кардиомиоци-тах, на проведение возбуждения в предсердиях и желудочках. Между тем возможность изменения электрофизиологических процессов в сердце под действием каннабиноидов представляется достаточно вероятной, поскольку каннабиноиды обладают антиаритмической активностью (Угдыже-кова и др., 2000а, 20006), т.е. оказывают эффект, который, по современным представлениям, связан с электрофизиологическими процессами в сердце (Мазур, Абдалла, 1995). В экспериментах, выполненных на изолированном перфузируемом сердце, как и в опытах in vivo, был зафиксирован отрицательный инотропный эффект Д9-ТНС (Graham et al., 1978; Manno, Manno, 1973; Smiley et al., 1976). О влиянии этих каннабиноидов на ритм сокращений изолированного сердца литературные источники давали противоречивую информацию (Li, 1980; Manno, Manno, 1973; Smiley et al., 1976). Складывалось впечатление, что отрицательный инотропный эффект Д9-ТНС связан с прямым действием на сердце, а брадикардия является результатом каннабиноид-индуцированного изменения активности вегетативной нервной системы, иннервирующей сердце. Кроме того, было установлено, что Д9-ТНС активирует СВ1-ре-цепторы и блокирует СВ2-рецепторы (Bayewitch et al., 1996), поэтому было неясно, является ли тот либо иной эффект Д9-ТНС следствием активации или блокады СВ-рецепторов. К тому же оказалось, что Д9-ТНС может оказывать неспецифические эффекты, не связанные с оккупацией канна-биноидных рецепторов (Felder et al., 1992). Таким образом, к началу 90-х гг. XX в. сложилась парадоксальная ситуация: данных о кардиоваскуляр-ных эффектах Д9-ТНС было достаточно много, но было непонятно, в какой мере эти эффекты связаны с активацией СВ-рецепторов.
Мы попытались выяснить значение кардиаль-ных каннабиноидных рецепторов в регуляции
сердечного ритма, сократимости миокарда и электрофизиологических процессов в сердце.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование состояло из двух фрагментов. Первый был выполнен in vivo на крысах линии Вистар массой 200-250 г, наркотизированных хлоралозой (50 мг/кг внутрибрюшинно). Второй был выполнен in vitro на изолированных перфу-зируемых сердцах крыс.
Эксперименты in vivo. ЭКГ регистрировали во втором грудном отведении с помощью усилителя биопотенциалов УБФ4-03 (Россия) и компьютера Pentium с оригинальной прикладной программой для записи и обработки ЭКГ. Запись ЭКГ осуществляли в течение 15 мин после инъекции СВ-агонистов и в течение 25 мин после внутривенного введения СВ-антагонистов. Об электрофизиологических процессах в сердце судили по таким косвенным показателям, как продолжительность интервалов PQ, QRS, QT. Скорость проведения возбуждения в желудочках оценивали по продолжительности комплекса QRS (Мазур, Абдалла, 1995). Пред-сердно-желудочковую проводимость определяли по величине интервала PQ (Мазур, Абдалла, 1995). О скорости реполяризации клеток сердца судили по величине интервала QT, корректированного на частоту сердечных сокращений (QTc) (Мазур, Абдалла, 1995; Van de Water et al., 1989). Для активации каннабиноидных рецепторов животным внутривенно вводили следующие препараты: неселективный агонист СВ1- и СВ2-рецепторов HU-210 ((6aR)-trans-3-(1,1-Dimethylheptyl)-6a,7,10,10a-tet-rahydro-1-hydroxy-6,6-dimethyl-6H-dibenzo[b,d]py-ran-9-methanol) (Mechoulam et al., 1988); селективный СВ1-агонист ACPA (arachydonylcyclopropyla-mide) (Hillard et al., 1999); эндогенный СВ-агонист анандамид (Devane et al., 1992); энзиморезистент-ный синтетический аналог анандамида, являющийся селективным агонистом СВ1-рецепторов, метанандамид ((R)-N-(2-hydroxy-1-methylethyl)-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenamide) (Abadji et al., 1994; Pertwee, 1999). В работе были использованы следующие антагонисты СВ-рецепторов: селективный СВ1-антагонист SR141716A (N-[piperidin-1-yl]-1-[1,2-dichlorophenyl]-4-methyl-1H-pyrazole-3-caboxamid HCl) (Mansbach et al., 1996) и селективный СВ2-антагонист SR144528 (N-(1S)-endo-1,3,3-trimethylbicyclo [2.2.1]hepta-2-yl]-5-(4-chlo-ro-3-methylphenyl)-1-(4-methyl-benzyl)-pyrazole-3-carboxamide) (Bouaboula et al., 1999), которые вводили внутривенно за 10 мин до инъекции каннабиноидов. Лиганды СВ-рецепторов применяли в следующих дозах: HU-210 - 0.1 мг/кг (0.25 мкмоль/кг); ACPA - 0.125 мг/кг (0.35 мкмоль/кг); анандамид -2.5 мг/кг (7 мкмоль/кг); метанандамид - 2.5 мг/кг (7 мкмоль/кг); SR141716A - 1 мг/кг (2.2 мкмоль/кг);
SR144528 - 1 мг/кг (2.1 мкмоль/кг). При выборе доз препаратов мы руководствовались приведенными в литературе данными. Так, известно, что в дозе 0.1 мг/кг HU-210 проявляет антиаритмические свойства (Крылатов и др. 2002; Угдыжекова и др., 2000а; 20006). В дозе 1 мг/кг SR141716A блокирует СВ1-рецепторы (Lichtman et al., 1998), а препарат SR144528 в дозе 1 мг/кг ингибирует СВ2-рецепторы (Hanus et al., 1999). Метананда-мид в дозе 2.5 мг/кг (7 мкмоль/кг) вызывал гипокинезию у крыс (Abadji et al., 1994; Romero et al., 1996). Его природный аналог анандамид использовали в эквимолярной дозе 2.5 мг/кг (7 мкмоль/кг). ACPA применяли в дозе 0.125 мг/кг (0.35 мкмоль/кг), которая в 20 раз меньше дозы метанандамида. В этой дозе ACPA вызывает кратковременный ги-потермический эффект (Hillard et al., 1999). Для блокады периферических вегетативных ганглиев использовали гексаметоний, который вводили внутривенно в дозе 10 мг/кг за 10 мин до каннаби-ноидов (Sander et al., 1989).
Все лиганды СВ-рецепторов ex tempore растворяли в смеси, состоящей из cremophore El : этанол : : 0.9%-ный NaCl (1 : 1 : 18), как рекомендовано в литературе (Adams et al., 1976; Mansbach et al., 1996). В ряде серий были использованы водорастворимые эмульсии, содержащие ACPA, анандамид, метанандамид. Гексаметоний растворяли в изотоническом растворе NaCl.
Эксперименты in vitro. Эти эксперименты проводили на крысах-самцах линии Вистар массой 250-300 г. После торакотомии сердце быстро извлекали и переносили в охлажденный (4°С) раствор Кребса-Хензелайта. После остановки сердце помещали в термостатируемую увлажненную камеру. В восходящую дугу аорты вводили канюлю, через которую поступал изотонический раствор. Ретроградную перфузию сердца проводили по методу Лангендорфа по открытому контуру. Сократительную функцию сердца регистрировали при перфузии под постоянным давлением 52 мм рт. ст. раствором Кребса-Хензелайта, насыщенным карбогеном (37°С, рН 7.4) и содержащим (в мМ): NaCl - 120; KCl - 4.8; CaCl - 2.0; MgSO4 - 1.2; KH2PO4 - 1.2; NaHCO3 - 20.0; глюкоза - 10.0. После стабилизационного периода в 20 мин регистрировали ЧСС и показатели сократимости изолированного сердца. В ходе эксперимента определяли следующие показатели: давление, развиваемое левым желудочком (мм рт. ст.) (ДРЛЖ); конечное диастолическое давление (КДД), последнее выражали в процентах от исходных величин. Давление, развиваемое левым желудочком, вычисляли как разницу между систолическим и диастоли-ческим давлением. Кроме того, рассчитывали скорость сокращения и скорость расслабления сердца. Стимуляцию кардиальных СВ-рецепторов осуществляли с помощью 10-минутной перфузии
сердца раствором Кребса-Хензелайта, содержащим СВ-агонист HU-210 в конечных концентрациях 100 нМ/ (38 мкг/л) и 1 мкМ (380 мкг/л). Вышеуказанные показатели регистрировали в трех точках: 1) сразу после 20-минутного стабилизационного периода; 2) после 10 мин перфузии с препаратом HU-210; 3) через 10 мин после перфузии без препарата ("отмывка" изолированного сердца). Препарат разводили в диметилсульфоксиде (DMSO) непосредственно перед экспериментом. Контролем служили изолированные сердца крыс, которые перфузировали раствором Кребса-Хензелайта, содержащим DMSO в конечной концентрации 10 мкг/л по той же схеме, что и HU-210. В ходе предварительных экспериментов было установлено, что DMSO в указанной концентрации не влияет ни на ритм, ни на силу сердечных сокращений.
Планируя эксперименты in vitro, мы столкнулись с проблемой выбора концентрации HU-210. С одной стороны, в экспериментах на изолированных препаратах сердца человека Bonz с соавт. (Bonz et al., 2003) использовали HU-210 в конечной концентрации 1 мкМ без всякой аргументации своего выбора. С другой стороны, в экспериментах на клетках линии N18TG2 Howlett с соавт. (Howlett et al., 1990) было показано, что Ki (константа ингибирования) у HU-210 составляет 7.2 нМ. В литературе нет данных о свойствах кардиальных СВ-рецепторов, поэтому мы использовали HU-210 в двух концентрациях: 0.1 и 1 мкМ.
В качестве показателя интактности препаратов изолированного сердца мы использовали определение активности креатинфосфокиназы (КФК) в перфузионном растворе, оттекающем от сердца. Активность КФК определяли на спектрофотометре Specord (Германия) стандартными коммерческими наборами компании "Biocon" (Германия). Перфузат, собранный за первые 10 мин стабилизационного периода, отбрасывали, поскольку он содержал кровь, поступающую в пер-фузионный раствор из полостей сердца и коронарного русла. Затем собирали перфузат за 30 мин последующей перфузии и рассчитывали общее количество КФК в этом перфузате. Масса сердца у крыс существенно варьирует. Следовательно, изменяется и количество КФК, поступающее в раствор, оттекающий от сердца, поэтому делали расчет КФК на 1 г массы сердца.
Агонисты каннабиноидных реце
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.