МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 4, с. 493-495
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 579.22+577.112
1-АМИНОЦИКЛОПРОПАН-1-КАРБОКСИЛАТДЕЗАМИНАЗА АЭРОБНОГО ФАКУЛЬТАТИВНО МЕТИЛОТРОФНОГО АКТИНОМИЦЕТА АМУСО1АТОР8К МЕТИАЛОЫСА 239 © 2015 г. Г. А. Екимова, Д. Н. Федоров, Н. В. Доронина, Ю. А. Троценко1
Пущинский государственный естественно-научный институт Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, Пущино
Поступила в редакцию 12.02.2015 г.
БО1: 10.7868/80026365615040072
Одним из ключевых механизмов влияния бактерий на рост и развитие растений является способность снижать уровень этилена за счет активности 1-аминоциклопропан-1-карбокси-латдезаминазы (АЦКД) (EC 3.5.99.7) [1]. Этот фермент катализирует гидролиз 1-аминоцикло-пропан-1-карбоксилата (АЦК), непосредственного предшественника в биосинтезе этилена, до а-кетобутирата и ионов аммония. Этилен — один из основных фитогормонов, он регулирует процесс старения, индуцирует созревание плодов и увядание цветков, а также играет важную роль в передаче стрессового сигнала [2]. Увеличение концентрации этилена в тканях растений как часть стрессовой реакции ингибирует удлинение корня, нодуляцию и транспорт ауксинов, ускоряет старение тканей и опадение листьев [3, 4]. Показано, что бактерии, обладающие АЦКД, способствуют повышению устойчивости растений к различным негативным воздействиям, таким как засуха, засоленность почвы, загрязнение тяжелыми металлами, присутствие фитопатогенов [1].
Факультативно метилотрофный актиномицет Amycolatopsis methanolica 239 способен использовать метанол в качестве ростового субстрата через рибулозомонофосфатный путь [5, 6]. Актиноми-цеты являются типичными почвенными бактериями, некоторые из них стимулируют развитие растений, обладая АЦК-дезаминазной активностью и синтезируя ауксины, однако молекулярно-биохи-мические основы их симбиоза не изучены [7]. В результате анализа геномов метилотрофных бактерий при помощи программы Protein BLAST (http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) нами выявлен структурный ген АЦКД (acdS) в геноме A. methanolica (GenBank: CP009110). Несмотря на то, что у многих бактерий обнаружена активность АЦКД, очищены и охарактеризованы только четыре фермента: из Pseudomonasputida UW4, Methylobacteri-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: trotsenko@ibpm.push-chino.ru).
um nodulans ORS2060, Methylobacterium radiotolerans JCM2831 и из дрожжей Cyberlindera saturnus (таблица). Сравнительное изучение ферментов, выделенных из других бактерий, позволит выявить закономерности в их структуре и свойствах.
Цель данной работы — очистка и исследование основных биохимических свойств АЦКД из Amycolatopsis methanolica 239.
Открытую рамку считывания гена acdS (локус NCBI AMETH_2787, Gene ID: 672357001) A. methanolica 239 клонировали в экспрессионном векторе pHUE по сайтам рестрикции Cfr42I и HindIII. На основе E. coli Rosetta получен штамм-суперпродуцент рекомбинантного белка AcdS, слитого на N-конце с убиквитином и полигистидиновой меткой. С использованием металл-хелатной аффинной хроматографии белок был очищен до электрофоретически гомогенного состояния. Затем в результате протеолиза получен препарат белка, аминокислотная последовательность которого в точности соответствует закодированной в гене acdS A. methanolica 239. Молекулярная масса субъединицы составила 36 кДа, что соответствовало теоретически рассчитанной. Методами нативного электрофореза и гель-фильтрации установлено, что молекулярная масса АЦКД составляет 144 кДа, что указывает на гомотетрамерную структуру белка.
Активность АЦК-дезаминазы определяли тремя способами: по образованию а-кетобутирата в сопряженной реакции с лактатдегидрогеназой и НАДН [8], колориметрическим методом по образованию а-кетобутирата, а также по образованию ионов аммония в сопряженной реакции с глута-матдегидрогеназой.
Показано, что при дезаминировании АЦК фермент A. methanolica подчиняется кинетике Михаэлиса—Ментен. Значение Km фермента составило 1.7 ± 0.2 мМ, что практически соответствует этому значению для АЦКД из M. radiotolerans JCM2831 (Km = 1.8 ± 0.3 мМ) (таблица). Для
494
ЕКИМОВА и др.
99
68
67
99
94
100
100
100
98
66
74
100
97
59
60
100
-Leifsonia rubra (WP 021808920) -Arthrobacter sp. 131MFCol6.1 (WP 018776131) -Arthrobacter crystallopoietes (WP 005268588) -Promicromonospora sukumoe 327MFSha3.1 (WP 020018078) -Brevibacterium casei S18 (WP 009379748) -Demetria terragena DSM11295 (WP 018157608) -Amycolatopsis methanolica 239 (WP 017982099) -Streptomyces acidiscabies 84-104 (WP 010352423) -Streptomyces prunicolor NBRC13075 (WP 019060563) -Meiothermus ruber DSM1279 (YP 003506726) -Meiothermus timidus DSM17022 (WP 018467328) -Methylobacterium sp. 4-46 (YP 001767276) -Methylobacterium nodulans 0RS2060 (YP 002500626) -Phyllobacterium brassicacearum (AB031418) -Agrobacterium radiobacter K84 (YP 002541606) -Bradyrhizobium japonicum USDA 110 (NP 766881) -Azorhizobium caulinodans 0RS571 (YP 001523183) -Methylobacterium radiotolerans JCM2831 (YP 001754199) -Mesorhizobium loti MAFF303099 (CAD31305) -Azospirillum lipoferum 4B (ABE66282) rRhizobium leguminosarum (ABP88063)
98
90
99
52
1001-Burkholderia mallei ATCC23344 (YP 105635) \-Burkholderia thailandensis E264 (YP 439298) ■Burkholderia glumae BGR1 (YP 002908968)
96
82 63
100
95 51
-Acidivorax ebreus TPSY (YP 002554583) -Methylibiumpetroleiphilum PM1 (YP 001022786) -Dickeya dadantii Ech703 (YP 002989081) -Pseudomonas syringae (YP 234886) —Pseudomonasfluorescens (ABR26447) -Enterobacter cloacae (AAD05069) -Serratia rubidaea (AEQ29824) Pseudomonasputida UW4 (Q5PWZ8) Pseudomonas entomophila (ACQ55296)
100 KSinorhizobium meliloti AK83 (ABS19884) 1001—Achromobacterpiechaudii HLE (WP 006223917) ^—Achromobacter xylosoxidans NH44784-1996 (YP 008027542) -Ralstonia eutropha H16 (YP 840884)
0.20
0.15
0.10
0.05
0
Филогенетическое дерево, построенное на основании транслированных аминокислотных последовательностей белка AcdS.
АЦКД из М. пойи1ат это значение самое низкое (Кт = 0.80 ± 0.04 мМ), следовательно, этот фермент проявляет наиболее высокую субстратную специфичность к АЦК среди охарактеризованных аналогов. Каталитическая константа фермента из А. теЛапоИеа (£са1 = 5.1 мин-1) значительно ниже, чем у всех ранее охарактеризованных ферментов (таблица). Такие различия в кинетических характеристиках могут быть связаны с раз-
личными местами обитания этих бактерий: М. пойи1ат является клубеньковым фитосим-бионтом, имеющим больший доступ к АЦК, тогда как М. гайюЫегат — филлосферная бактерия, а А. теЛапоИеа — свободноживущая почвенная бактерия, по-видимому, не связанная с поверхностью растений непосредственно.
Температурный оптимум фермента смещен в область повышенной температуры, что характер-
МИКРОБИОЛОГИЯ том 84 № 4 2015
1-АМИНОЦИКЛОПРОПАН-1-КАРБОКСИЛАТДЕЗАМИНАЗА 495
Сравнительная характеристика 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатдезаминаз
Параметры A. methanolica 239 M. nodulans 0RS2060 M. radiotolerans JCM2831 Pseudomonas putida UW4 Cyberlindera saturnus
Km, мМ 1.7 ± 0.2 0.80 ± 0.04 1.8 ± 0.3 3.4 ± 0.2 2.6
kcao мин-1 5.1 ± 0.2 111.8 ± 0.2 65.8 ± 2.8 146 ± 5 -
pH-оптимум 8.5 8.0 8.0 8.0 9.0
Температурный оптимум, °С 60 50 45 37 -
Молекулярная масса Гомотетрамер 144 кДа Гомотетрамер 144 кДа Гомотетрамер 144 кДа Гомотетрамер 168 кДа Мономер 69 кДа
Кофактор Пиридоксальфосфат
Ссылка Данная работа [9] [9] [10] [8]
но и для фермента из M. nodulans, максимальную активность которого наблюдали при 60°С. Напротив, температурный оптимум гомологичных ферментов из псевдомонад находился в диапазоне 30—37°С (таблица). АЦКД из A. methanolica проявляла наибольшую активность в 50 мМ трис-HCl при pH 8.5.
Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей показал, что АЦКД представителей филума Actinobacteria, образуют отдельный филогенетический кластер. AcdS из Amycolatopsis methanolica 239 проявил наибольшее сходство (83% идентичности) с AcdS из Streptomyces acidiscabies 84—104 (рисунок). Другой кластер формируют АЦК-дезаминазы альфапротеобактерий, в частности, представителей родов Rhizobium и Methylobacterium, ассоциированных с растениями. Также отдельный кластер образуют АЦКД бета- и гам-мапротеобактерий, в том числе единственный хорошо изученный фермент из Pseudomonas putida UW4 (рисунок). В целом, филогения АЦКД коррелирует с филогенией генов 16S рРНК, тем не менее, имеются данные о существенной роли горизонтального переноса в распространении и эволюции гена acdS, в том числе между царствами [11].
Таким образом, в настоящей работе впервые проведена очистка и исследованы основные биохимические свойства рекомбинантной АЦКД представителя филума Actinobacteria, факультативно метилотрофного актиномицета A. methanolica 239.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 14-04-32202-мол_а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Glick B.R., Todorovic B., Czarny J. Cheng Z, Duan J, McConkey B. Promotion of plant growth by bacterial ACC deaminase // Crit. Rev. Plant Sci. 2007. V. 26. P. 227-242.
2. Arshad M, Frankenberger W.T., Jr. Ethylene: Agricultural Sources and Applications. Kluwer Acad./Plenum Publishers, New York, 2002. P. 450.
3. Prayitno I., Rolfe B.G., Mathesius U. The ethylene-in-sensitive sickle mutant of Medicago truncatula shows altered auxin transport regulation during nodulation // Plant Physiol. 2006. V. 142. P. 168-180.
4. Sun Y, Cheng Z, Glick B.R. The presence of a1-ami-nocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase deletion mutation alters the physiology of the endophytic plant growth-promoting bacterium Burkholderia phyto-firmans PsJN // FEMS Microbiol. Lett. 2009. V. 296. P. 131-136.
5. De Boer L, Dijkhuizen L, Grobben G., Goodfellow M., Stackebrandt E, Parlett J.H., Whitehead D., Witt D. Amycolatopsis methanolica sp. nov. a facultatively meth-ylotrophic actinomycete // Int. J. System. Evol. Microbiol. 1990. V. 40. P. 194-204.
6. Khmelenina V.N., Tsvetkova M.G., Beschastnyi A.P., Trotsenko Y.A. Peculiarities of metabolism of the meth-ylotrophic actinomycete Amycolatopsis methanolica // Micro
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.