ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2013, том 60, № 3, с. 416-423
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 581.1:577.152.1
2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛ - ТРИГГЕР ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В КЛЕТКАХ КАЛЛУСА ¥а§оругиш ХаХапсиш
© 2013 г. Е. А. Науменко*, Г. В. Сибгатуллина**, А. Р. Мухитов**, А. А. Родионов*,
О. Н. Ильинская*, Р. П. Наумова*
*Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань **Федеральное государственное бюджетное учреждение наук Казанский институт биохимии и биофизики
Казанского научного центра РАН, Казань Поступила в редакцию 01.06.2012 г.
Воздействие 2,4,6-тринитротолуола (ТНТ) на каллусные клетки гречихи татарской (Fagopyгum tШаг-кит (Ь.) ОаегШ) сопровождалось появлением продуктов шестиэлектронного восстановления орто-или паранитрогрупп ксенобиотика — 2-амино-4,6-динитротолуола (2-АДНТ) и 4-амино-2,6-дини-торотолуола (4-АДНТ). Выявлено, что ТНТ индуцирует нарушение целостности мембраны клеток, что, вероятно, связано с одноэлектронным восстановлением ксенобиотика, сопряженного с образованием нитроанионного радикала и супероксид-аниона.
Ключевые слова: Fagopyгum tataгicum — каллус — 2,4,6-тринитротолуол — активные формы кислорода — окислительный стресс
Б01: 10.7868/8001533031303010Х
ВВЕДЕНИЕ
2,4,6-тринитротолуол (ТНТ) относится к широко распространенным компонентам взрывчатых смесей. Его токсический и мутагенный потенциал был выявлен с привлечением тест-организмов различного эволюционного уровня — от бактерий до млекопитающих [1, 2]. Агентство по защите окружающей среды США отнесло ТНТ к числу опасных загрязнителей биосферы [3].
Данные литературы подтверждают участие растений в превращении и деградации многих стабильных экологически опасных соединений, благодаря чему сорные травы и культурные растения широко используются для удаления опасных органических загрязнений и токсичных металлов из промышленных сточных вод, а также в фито-ремедиации загрязненных территорий [4]. Способность растений осуществлять деградацию значительной части известных токсикантов, наряду с экономичностью и простотой реализации мето-
Сокращения: 2-АДНТ — 2-амино-4,6-динитротолуол; 4-АДНТ — 4-амино-2,6-диниторотолуол; ТНТ — 2,4,6-тринит-ротолуол; ГАДНТ — гидроксиламинодинитротолуолы; ДАНТ — диаминонитротолуолы; ДАФИ — 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид; ПИ — пропидиум иодид; Тгоп — 4,5-диоксибензол-1,3-дисульфонат натрия. Адрес для корреспонденции: Науменко Екатерина Анатольевна. 420008 Казань, ул. Кремлевская, 18. Казанский (Приволжский) федеральный университет. Электронная почта: ekaterina.naumenko@gmail.com
дов фиторемедиации, открывает новые перспективы в экологической биотехнологии, основанные на совместном использовании детоксикаци-онного потенциала растений и ассоциированной с ними микрофлоры.
В публикациях по трансформации ТНТ растениями речь идет, как правило, о его превращении по пути нитроредукции с образованием в качестве мажорных метаболитов 2-амино-4,6-динит-ротолуола (2-АДНТ) и 4-амино-2,6-диниторото-луола (4-АДНТ) [5]. У ряда растений (урути водной, ревеня тангутского) в ходе трансформации идентифицированы продукты дальнейшего восстановления ТНТ — изомерные диаминонитротолуолы (ДАНТ) [6]. Характерной особенностью фитотрансформации ТНТ является связывание производных ТНТ с клеточными компонентами, а именно с шестиуглеродными соединениями с образованием соответствующих глюкозидов, катализируемое глюкозилтрансферазами [7, 8]. На физиологическом уровне токсическое воздействие ТНТ проявляется в значительной задержке развития проростков и снижении скорости вторичного роста побегов и корней [9]. На клеточном уровне ТНТ способен вызывать появление дополнительных контактов между мембранными структурами растительной клетки, а также ее деструкцию [10]. Однако механизмы фитотоксич-ности ТНТ и причины устойчивости отдельных видов растений к его действию в настоящее время
недостаточно изучены. Как было показано ранее в экспериментах с бактериями, в процессе трансформации ТНТ происходит образование активных форм кислорода (АФК), которое инициируется одноэлектронным восстановлением ТНТ с образованием токсичного нитроанионного радикала в реакции, катализируемой "кислород-чувствительной" нитроредуктазой [11, 12]. Хорошо известно также негативное действие АФК на клетки живых организмов [13]. Можно предположить, что токсическое действие ТНТ опосредовано окислительным стрессом. В настоящее время вопрос образования АФК при воздействии ТНТ на растительные клетки остается неизученным. Представляется важным изучить, сопровождается ли трансформация ТНТ растениями развитием в их клетках окислительного стресса, и определить степень его летальности.
Удобной моделью для исследования воздействия различных соединений на клетки растений являются каллусные культуры, поскольку их использование позволяет стандартизировать условия окружающей среды, проводить исследования вне зависимости от времени года и получать большое количество статистически достоверных результатов за короткое время. Кроме того, применение каллусных культур для изучения ТНТ-трансформирующей активности растений позволяет исключить участие микроорганизмов, что неизбежно в растительно—микробных системах, а также связывание ксенобиотика и/или его метаболитов с гумусовыми соединениями в почве. В настоящей работе был использован неморфоген-ный каллус гречихи татарской, который представлен клетками одного (паренхимного) типа, что облегчает интерпретацию полученных результатов.
Целью работы стала характеристика особенностей начального этапа трансформации ТНТ клетками неморфогенного каллуса гречихи татарской, выявление возможности генерации АФК при контакте растительных клеток с ТНТ и оценка их функционального состояния на фоне развивающегося окислительного стресса.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. В работе использовали неморфогенный каллус гречихи татарской (¥а-gopyrum 1а1аг1еыт (Ь.) Оаейп). Морфология и получение таких культур были описаны ранее [14]. Каллусные культуры поддерживали в термостате при температуре 26 ± 2°С в темноте на каллусо-генной среде ЯХ [14], содержавшей минеральные соли среды Гамборга В5 [15] с добавлением 2 мг/л тиамина, 1 мг/л пиридоксина, 1 мг/л никотиновой кислоты, 2 г/л гидролизата казеина, 2 мг/л 2,4-Д, 0.5 мг/л ИУК, 0.5 мг/л нафтилуксусной кислоты, 0.2 мг/л кинетина. В работе была ис-
пользована культура, отобранная на 7-е сутки культивирования.
Трансформация ТНТ каллусными клетками.
1.5 г сырой каллусной массы переносили с агари-зованной среды RX в 25 мл буфера (30 мМ Na2HPO4, 20 мМ KH2PO4; рН 7.0), содержащего ТНТ в концентрации 0.22 или 0.44 мМ, и инкубировали при 25°С в аэрируемых условиях (время инкубации — от 15 до 180 мин). В контрольном варианте буфер не содержал ТНТ. Анализ ТНТ и его метаболитов проводили без или после обработки образцов на ультразвуковой бане SONOREX DIGITAL 10 P ("Bandelin", Германия) в течение 5 мин (мощность 250 Вт, рабочая частота 35 кГц). Инкубационную жидкость освобождали от клеток фильтрованием через нейлоновые фильтры Gelman, ("Ann Arbor", США) с диаметром пор 0.2 мкм.
ВЭЖХ-анализ проводили на хроматографе Series 200 ("Perkin Elmer", США), оснащенном диодным детектором, предколонкой Supelcosil LC-8 и колонкой Supelcosil octyl C-8 (150 х 4.6 мм; 5 мкМ). Метаболиты детектировали при длинах волн 230 и 254 нм. Элюцию проводили в изокра-тическом режиме системой растворителей ацето-нитрил : вода (40 : 60) при скорости 0.5 мл/мин и температуре 36°С.
Определение супероксид-аниона (O^-) спек-трофотометрическим методом. Метод основан на окислительном превращении эпинефрина в адре-нохром при взаимодействии с супероксидным радикалом [16]. К 2 мл освобожденной от клеток инкубационной жидкости добавляли 200 мкл 0.1% водного раствора гидрохлорида эпинефрина и после 15-минутной инкубации проводили измерения при 480 нм против освобожденной от клеток инкубационной жидкости на спектрофотометре Lambda 35 ("Perkin Elmer").
ЭПР-спектрометрия АФК. Определение генерации АФК методом ЭПР проводили с использованием спиновой ловушки 4,5-диоксибензол-1,3-дисульфонат натрия (Tiron) ("Sigma-Aldrich",
Германия), при взаимодействии которой с O2— в щелочной среде образуется ЭПР-детектируемый стабильный радикал — Tiron-семихинон [17]. ЭПР-спектры супероксида регистрировали на спектрометре ESP-300 ("Bruker", Германия) при комнатной температуре (~25°C) и следующих параметрах измерения: СВЧ мощность 50 мВт, СВ частота 9.8 ГГц, амплитуда ВЧ модуляции 0.5 Гаусс. Tiron (50 мМ) добавляли к исследуемым растворам после отделения клеток, рН доводили до 9.5—10.0, добавляя 20% раствор NaOH. Образцы в объеме 20 мкл помещали в стеклянные капилляры. Эталонные спиновые аддукты получали, применяя модельные системы образования
АФК. Для генерации O2 использовали ксантин-
Содержание остаточного ТНТ и его метаболитов в суспензии клеток Г. tataricum через 8 ч инкубации (исходная концентрация ТНТ 0.22 мМ)
Соединение Время удерживания при ВЭЖХ, мин Концентрация соединений, мМ
до УЗ-обработки после УЗ-обработки
2-АДНТ 17.9 0 0.020 ± 0.003
4-АДНТ 19.1 0 0.030 ± 0.005
ТНТ 22.9 0.100 ± 0.005 0.110 ± 0.010
Примечание. УЗ-обработка — обработка ультразвуком.
ксантиноксидазную реакцию. Реакционная смесь содержала 10 мл 0.05 М фосфатного буфера, 1.52 г ксантина и 0.5 ед. ксантиноксидазы молока (3.125 мг белка) ("Sigma-Aldrich"). «ОН генерировали в реакционной системе Фентона, содержащей 0.5 мМ H2O2 и 75 мкМ Fe2+ в виде сульфата железа (II). Обработку ЭПР-спектров проводили с использованием программы Origin 6.0.
Флуоресцентная микроскопия. Выявление особенностей физиологического состояния растительных клеток при воздействии ТНТ проводили с использованием двойного окрашивания флуоресцентными красителями: пропидиум иодидом (ПИ) и 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидро-хлоридом (ДАФИ) [18] на конфокальном лазерном флуоресцентном микроскопе LSM 510 META ("Carl Zeiss", Германия). Данный метод основан на способности ПИ проникать исключительно в клетки, имеющие повреждения в плазмалемме. ПИ связывается с ДНК таких клеток, что приводит к развитию флуоресценци
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.