УДК 577.218
5S рРНК-УЗНАЮЩИЙ МОДУЛЬ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА СТС И ЕГО ЭВОЛЮЦИЯ
© 2008 г. А.В. Коробейникова, Г.М. Гонгадзе*, А.П. Корепанов, Б.Д. Елисеев, М.В. Баженова, М.Б. Гарбер
Институт белка РАН, 142290Пущино, Московская обл.; факс: (495)632-7871, электронная почта:gongadze@vega.protres.ru
Поступила в редакцию 27.06.07 После доработки 28.09.07
Проведен анализ влияния аминокислотных замен в РНК-связывающих участках гомологичных рибосом-ных белков TL5 и L25, принадлежащих к семейству СТС, на способность этих белков образовывать комплексы с рибосомной 5S РНК. Показано, что одновременные замены на аланин даже трех неконсервативных аминокислотных остатков в РНК-связывающем участке белка не приводят к существенному изменению стабильности комплекса TL5-5S рРНК. Тогда как замена любого из пяти консервативных остатков РНК-связывающего участка как в TL5, так и в L25 приводит к сильной дестабилизации или полной невозможности образования комплекса. Именно эти пять остатков формируют РНК-узнающий модуль в данных белках. Они строго консервативны в белках семейства СТС. Имеются, однако, несколько случаев природных замен этих остатков в гомологах данных белков в Bacilli и Cyanobacteria, которые сопровождаются определенными заменами и во взаимодействующем с СТС участке 5S рРНК соответствующего организма. Мы выделили белки СТС и фрагменты 5S рРНК Enterococcus faecalis и Nostoc sp. и проверили их способность образовывать специфические комплексы. Оказалось, что данные белки образуют стабильный и специфический комплекс только с 5S рРНК той же бактерии. Эти случаи — пример коэволюции структур двух взаимодействующих макромолекул.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: бактериальные 5S рРНК-связывающие белки, белки семейства СТС, рибосома.
Ранее нами была обнаружена гомология между рибосомными белками L25 Escherichia coli, TL5 Thermus thermophilus и основным стрессовым белком СТС Bacillus subtilis [1]. Впоследствии все известные гомологи белка СТС B. subtilis были объединены в так называемое «семейство СТС» [2]. Проанализировав известные геномы из банков данных [3, 4], мы обнаружили, что гены белков семейства СТС присутствуют только в геномах бактерий. Белки данного семейства, такие как L25 E. coli, TL5 T. thermophilus и CTC Deinococcus radiodurans, можно считать истинными рибосомными белками, так как они были обнаружены в рибосомах экспоненциально растущих клеток [5—7]. Эти белки специфически связываются с консервативным участком 5S рРНК, так называемой «петлей Е» [7—9]. В то же время было показано, что некоторые представители данного семейства, а именно белки СТС B. subtilis и Listeria monocytogenes, продуцируются клетками только при стрессе [10—12]. Основной стрессовый белок СТС B. subtilis способен специфически связываться с 5S рРНК и обнаруживается в рибосомной фракции при
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
различных неблагоприятных для роста клеток условиях [13, 14]. Этот белок семейства можно считать только временно ассоциированным с рибосомой. В то же время в геномах представителей некоторых бактериальных семейств, таких как Streptococcaceae и Mycoplasmataceae, ген белка СТС вообще отсутствует [3, 4]. Среди белков семейства СТС есть однодоменные, двухдо-менные и даже трехдоменные [2, 7, 15], и все они имеют домен, гомологичный 5S рРНК-свя-зывающему однодоменному рибосомному белку L25 E. coli. О биологической функции белков данного семейства пока ничего не известно. Однако все изученные белки семейства СТС объединяет одно свойство: они способны специфически взаимодействовать с определенным участком рибосомной 5S РНК.
Двухдоменный рибосомный белок TL5 T. thermophilus был открыт и детально изучен в нашей группе [1, 2, 6, 9, 16—18]. Было показано, что изолированный N-концевой домен белка TL5 (NfrTL5) обладает такой же 5S рРНК-свя-зывающей способностью, как и полноразмерный белок [9]. Пространственные структуры белков L25 E. coli и TL5 T. thermophilus в комплексе с одинаковым фрагментом 5S рРНК E. coli
были определены с высоким разрешением [2, 19]. Было показано, что, несмотря на низкую гомологию первичных структур белка L25 и NfrTL5 (18% идентичных остатков), их пространственные структуры и способ взаимодействия с РНК очень похожи [2]. Аминокислотные остатки данных белков, образующие водородные связи с РНК, можно разделить на две группы, неконсервативные и консервативные [18]. Остатки первой группы (K14, S16, R20, R31, N34, R72, Q73 и N75 в белке TL5) расположены по периферии контактирующей с РНК поверхности белка, и образуют доступные воде межмолекулярные водородные связи (рис. 1). Остатки второй группы (R10, R19, Y29, H85 и D87 в белке TL5) расположены в центральной части контактирующей с РНК поверхности белка и образуют межмолекулярные водородные связи, недоступные для воды.
В предыдущей работе [18] мы показали, что замены любого из остатков второй группы в белке TL5 приводят к значительной дестабилизации РНК-белкового комплекса или к невозможности его образования. Было также показано, что некоторые единичные замены остатков первой группы в белке TL5 на аланин не влияли на РНК-связывающие свойства белка. Был сделан вывод о том, что недоступные растворителю водородные связи, образованные консервативными остатками белка TL5 с РНК, являются главным фактором в межмолекулярном узнавании. Наблюдаемые у представителей Bacilli и Cyanobacteria случаи природных замен аминокислотных остатков второй группы в белках СТС с одновременными изменениями нуклео-тидного состава петли Е 5S рРНК позволили нам выдвинуть гипотезу о коэволюции структур данных макромолекул.
В данной работе проведен детальный анализ вклада аминокислотных остатков обеих групп в белке TL5 и вклада остатков второй группы в белке L25 в формирование соответствующих РНК-белковых комплексов. Показано, что в отличие от замен остатков второй группы, единичные замены любого остатка первой группы белка TL5 (исключая N34) и даже одновременные замены двух или трех остатков этой группы на аланин не оказывают заметного влияния на РНК-связывающие свойства белка. Кроме того, нами был исследован вклад межмолекулярных электростатических взаимодействий в формирование и стабильность комплекса белка TL5 с 5S рРНК. Показано, что электростатические взаимодействия не вносят заметного вклада в стабильность комплекса белка TL5 с 5S рРНК. Получены стабильные гомологичные комплексы специфических фрагментов 5S рРНК с бел-
ками СТС Enterococcus faecalis и Nostoc sp. (представители Bacilli и Cyanobacteria соответственно). Эти результаты подтверждают наше предположение о том, что одновременные изменения в структурах белков СТС и 5S рРНК данных организмов, произошедшие в процессе эволюции, направлены на сохранение этими молекулами способности образовывать стабильный комплекс.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клонирование генов рекомбинантных белков.
Клонирование фрагмента гена белка TL5 T. ther-mophilus (ntl5), кодирующего его N-концевой фрагмент (NfrTL5), а также некоторых его мута-нтных форм описано в работе [18]. Мутантные ntl5 амплифицировали с помощью полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) в два этапа. В качестве матрицы для ПЦР при введении одиночных замен использовали плазмиду pET11c/ntl5. При введении двойных или тройных замен использовали плазмиды, кодирующие мутантные NfrTL5 с одной или двумя соответствующими заменами. На первом этапе с помощью специфических праймеров, один из которых содержал необходимые замены, получали небольшой фрагмент ntl5 (5'- или 3'-концевой в зависимости от положения мутации). На втором этапе получали полноразмерный ntl5, несущий запланированные мутации. Если мутация находилась в начале гена, прямым праймером служил фрагмент ntl5, полученный на первом этапе, обратным - T7Rev (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'). Если мутация находилась в конце гена, прямым праймером служил T7For (5'-TAATACGACT-CACTATAGGG-3'), обратным — фрагмент ntl5, полученный на первом этапе. Мутантные ntl5 клонировали в вектор pET11c («Novagen», США) по сайтам рестрикции Nde I и BamH I. Для получения конструкций, кодирующих мутантные формы белка L25 E. coli, следовали протоколу QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit («Stratagene», США). В качестве матрицы в ПЦР использовали плазмиду pKAB101 [20], несущую ген белка L25. Гены белков СТС E. faecalis и Nostoc sp. амплифицировали с помощью ПЦР с хромосомных ДНК и клонировали в вектор pET11c по сайтам Nde I и BamH I. В качестве прямого праймера для гена белка СТС E. faecalis использовали 5'-GAATTAGGTTCATAT-GTCAGTACAATTAGAA GT-3', для гена белка СТС Nostoc sp. — 5'-CTAAACCCATATGGCTCT-GACAGTCGAAC-3'. В качестве обратного праймера для гена белка СТС E. faecalis использовали 5'-GTGGGATCCTTATTCGGCTAATTCTG-
GTTC-3', для гена белка СТС Nostoc sp. — 5'-TG-GGATCCCTTTAGCCTTTGGCAGTAGC-3'.
Получение рекомбинантных белков в клетках E. coli и их очистка. Гены, кодирующие мутант-ные формы белка L25, экспрессировали в клетках E. coli, штамм KNB800 [20]. Клетки выращивали в 1 л среды LB, содержавшей 50 мкг/мл ка-намицина, при 37° до OD590 = 2— 2 , 5. Для экспрессии генов других рекомбинантных белков использовали экспрессионную систему Штудиера [21]. Соответствующими плазмидами трансформировали клетки E. coli, штамм BL21(DE3) («Novagen»). Клетки выращивали в 1 л среды LB, содержавшей 100 мкг/мл ампициллина, при 37° до OD590 = 0,5—0,7. Экспрессию рекомбинантных генов индуцировали добавлением изопропил-1-тио^^-галактопиранозида до конечной концентрации 1 мМ. После индукции клетки растили в течение 3 часов. Затем клетки осаждали центрифугированием и хранили при —70°. Очистку NfrTL5 и его мутантных форм проводили по описанной ранее методике [18]. Для выделения белков СТС E. faecalis или Nostoc sp. клетки суспендировали в буфере следующего состава: 50 мМ Tris-HQ, рН 7,5, 0,8 М NaCl, 20 мМ MgCl2, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ ß-мек-раптоэтанол и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора Sonic Dismembrator 550 («Fisher scientific», США). Затем центрифугированием последовательно осаждали клеточный дебрис и рибосомы. Полученный супернатант разбавляли в 10 раз буфером (50 мМ Tris-НС!, рН 7,5,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.