БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 1, с. 80-87
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА
УДК 577.3
АСМ -И ССЛЕДОВАНИЕ ЗАВИ СИМОСТИ ОЛИГОМЕРНОГО СО СТОЯНИЯ ЦИТОХРОМА BM3 ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ
© 2015 г. Н.С. Бухарина, Ю.Д. Иванов, Т.О. Плешакова, П.А. Французов, Н.Д. Иванова*, Н.В. Крохин, Н.А. Петушкова, А.И. Арчаков
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10/8; E-mail: natalie_buharina@list.ru *Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина,
109472, Москва, ул. А кадемика Скрябина, 23 Поступила в p едакцию 29.05.14 г.
И сследованы тепловая денатурация и агрегация цитохрома P450 BM3 с помощью атомно-си-лового микроскопа. Для определения характерных температурных переходов был использован флуоресцентный анализ. В низкотемпературной области плавления (10-33)°C наблюдался спад интенсивности флуоресценции в области ароматических групп и ее синхр онный рост в области флавиновых групп. Плавление в этой области сопровождалось последовательностью из трех узких S-образных кооперативных переходов при температурах 16, 22 и 29°C. C помощью атомно-силовой микроскопии в этой области температур показано сохранение глобулярной формы молекул BM3 в виде компактных объектов (высота h < 7 нм, латеральные размеры d < 50 нм) при изменении степени олигомеризации белка: первые два перехода сопровождались уменьшением степени олигомеризации, а третий - увеличением.
Ключевые слова: цитохром P450, BM3, атомно-силовая микроскопия, кооперативный переход, температурная денатурация.
Флавоцитохром Р450 ВМ3 (ВМ3) принадлежит к суперсемейству гемсодержащих ферментов цитохромов Р450 и катализир ует моно-оксигенацию жирных кислот [1]. Он представляет собой бактериальный фермент с молекулярной массой 119 кДа [1] и является белком, содержащим редуктазный (РМК/РЛБ) и гемо-вый домены в единой полипептидной цепи [2]. Каталитическая активность ВМ3 обусловлена перено сом электр онов с КЛБРЫ-кофактора через редуктазу на гем [3]. При этом ВМ3 формирует димеры, которые проявляют большую активность, чем мономеры [4].
Температурная денатурация фермента и определение влияния температуры на его активность обычно исследуется для выяснения механизма функционир ования фер мента. В нашей пр едыдущей р аботе с помощью атомно-силовой микр о скопии (А С М) было показано, что максимум активности единичных молекул ВМ3, нековалентно иммобилизованных на поверхности слюды, наблюдается пр и темпер а -тур е 22°С в диапазоне темпер атур (16-28)°С [5]. Авторами работы [6] было обнаружено,
Сокращение: АСМ - атомно-силовая микроскопия.
что температурная зависимость каталитической активности BM3 имеет колоколообр азный вид с максимумом пр и T ~ 25°С, пр и этом для солюбилизированного белка уменьшение активности пр и T > 25°С более выр ажено, чем для белка, иммобилизованного в золь-гель-матр ице. П р и этом темпер атур ы плавления интактного BM3, определенные с помощью дифференциальной сканирующей калориметр ии, со ставили 48 и 63°С [7]. Низкое по ср ав-нению с температурой плавления значение температуры, соответствующей максимуму активности иммобилизованного BM3, может быть связано с нестабильностью электронного транспорта через FMN и FAD на гем, обусловленной возможным изменением структур ы и олигомер ного со стояния фер мента под влиянием темпер атур ы.
Цель данной работы заключалась в исследовании температурной денатурации BM3 в диапазоне температур (10-37)°С. И спользован-ный подход включал в себя мониторинг плавления BM3 с помощью флуоресцентного анализа и исследование его олигомерного состояния в процессе температурной денатурации с использованием атомно-силовой микроскопии. АСМ позволяет получать данные о структур-
ных особенностях белка и о его олигомерном состоянии в условиях, близких к нативным, с субнанометровым разрешением. Точность определения высоты белка с помощью А СМ со -ставляет ~0,1 нм, что ср авнимо с р азрешением рентгеноструктурного анализа при определении структуры белка [8]. Метод АСМ был ранее использован для визуализации белков цитохром Р450-содер жащих систем и их комплексов [9-11], а также для определения олигомерного состояния белков путидаредоксинр едуктазы и BM3 в различных условиях АСМ-измерений [12,13].
Флуоресцентный анализ был использован для определения характер ных температур ных переходов на кривой плавления фермента. Внутренними флуорофорами BM3 являются остатки ароматических аминоксилот - аминокислотные остатки тирозина (Туг), триптофана (Тгр) и фенилаланина (Phe), а также про стетические флавиновые группы - FAD и FMN. Наличие таких флуорофоров позволяет использовать метод флуоресцентного анализа для прямого изучения BM3 без меток [14,15]. Интенсивность флуоресценции ароматических остатков зависит от диэлектрической константы окр ужающей их среды, а флуоресценция FAD/FMN возрастает при денатурации флавопротеинов [16,17].
В представленной работе было показано, что наблюдается локальное плавление BM3 в низкотемпературной области (10-30)°С, которое влечет изменение степени олигомеризации белка без изменения его глобулярной формы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали 10 мМ фосфатно-солевой буфер (PBSD, Pierce, США), рН 7,4, содержащий 8 мМ NaH2PO4, 2 мМ KH2PO4, 140 мМ Nad, 10 мМ КС1. Деионизованную ультрачистую воду получали на установке Sim-рИску UV (Mil^cre, США).
Цитохр ом P450 BM3 был любезно предо ставлен проф. A.W. Munro (Манчестерский Университет, Великобритания) и В.Г. Згодой (ИБМХ PАМН, Москва, Pоccия), экспрессиро -ван согласно [4,18]. Концентрацию BM3 опр е-деляли на спектрофотометре Model 8453 (Agilent, США) при 25°С в соответствии с методом, описанным в работе [19].
Флуоресцентный анализ. Спектры флуоресценции ра створ ов BM3 были получены на флуоресцентном спектрометре LS55 (Perkin Elmer, США). Длина волны возбуждения составляла 280 нм, а диапазон спектра излучения - 290600 нм. Спектральные ширины щелей спектро -метра составляли 4,5 нм для линий возбуждения и излучения. Измерения проводили в кварцевой
кювете c длиной оптического пути 1 см и объемом 3 мл. Концентр ация BM3 в PBSD-бу-фер е р авнялась 10-7 M. Температур у в кювете поддерживали с помощью термостата Haake DO (Fisons S^endf^ Едшртеп!, Великобритания). Измер ения проводили чер ез 2 мин после достижения заданной температуры в термостате. Спектры были сняты в темпер атурном диапазоне от 10 до 30°С с шагом 2°С. Также спектр ы были сняты пр и температуре 33 и 37°С. Измерения для раствора BM3, нагретого до 33°С, а затем охлажденного до 16°С, так называемый режим «охлаждение после нагревания», проводили следующим образом: после нагревания кювету с раствором белка охлаждали с помощью дополнительной секции водно-ледяной бани, встроенной в тер мостат.
Экспериментально полученные спектры флуоресценции BM3 были аппроксимированы экспоненциальной функцией:
y = y0 + Aехр( - e(-z) - z + 1), (1)
z = (x - xc)/w.
Для каждой заданной температуры на спектре флуоресценции был найден максимум в диапазонах 320-360 нм и 520-550 нм, что со -ответствует излучению ароматических и фла-виновых хр омофор ных групп BM3 соответственно.
АСМ-визуализация BM3. Иммобилизация BM3 осуществлялась за счет нековалентной адсорбции молекул на А СМ -чипе, в качестве которого использовали свежесколотую слюду (SPI, С ША). Растворы белка для иммобилизации, АСМ-подложку и буфер для промывки предварительно термостатировали при заданной температур е (10, 17, 22, 30°С) следующим образом: раствор белка и буфер выдерживали в термошейкере (20 мин, Thermomixer ^mi^ort, Еррепёог^; АСМ -подложку выдерживали в тер-мошейкере (для 17°С < Т < 30°С, 20 мин, Thermoshake Gerhardt) или (только для 10°С) в холодильнике (Атлант, Белоруссия).
А СМ -измерения пр оводили в жидкости для образцов, приготовленных и визуализированных при температурах 10, 17, 22, 30°С. Для этих исследований образцы готовились следующим обр азом. Раствор белка (4 мкл, 0,18 мкМ, 10 мМ PBSD-буфер, рН 7,4) наносили на поверхность АСМ-чипа и инкубировали 3 мин. Далее поверхность А СМ -подложки промывали PBSD-буфер ом, влажную А СМ -подложку с BM3 сразу помещали в тер мостатир уемую жидкостную ячейку АСМ, содержащую 2,5 мМ PBSD-буфер, рН 7,4. АС М -сканир ование про -
Рис. 1. Пример спектров флуоресценции (Аех = 280 нм), полученных при температуре 22°С в
кварцевой кювете: (--) - спектр флуор есценции
ВМ3 и (---) - его аппроксимация уравнением (1);
(• • •) - контрольный спектр флуор есценции 10 мМ РВ8Б-буфера, рН 7,4 без белка. Экспериментальные условия: ВМ3 (10-7 М) в 10 мМ РВ8Б-буфер е, рН 7,4.
водили на атомно-силовом микр оскопе NTEG-RA Vita (НТ-МДТ, Россия) с использованием зондов DNP-S10 (Bruker, США) с константой жесткости 0,32-0,58 Н /м и радиусом кривизны 10-20 нм.
Для А СМ -измерений использовали полуконтактный режим при скорости сканирования 0,5 1 Гц. В каждом эксперименте сканиро-валось не менее 10 кадров, размеры которых по X и Y составляли от 0,5 до 5 мкм. Каждый АСМ -экспер имент был проведен не менее трех раз.
В контрольных экспериментах проводили АСМ -визуализацию поверхности слюды после инкубации в воде и соответствующем буфере, не содержащем белок. Размер неспецифических объектов, зарегистрированных на АСМ-под-ложке, в контрольных экспериментах не превышал 0,8 ± 0,1 нм, а их количество на кадре площадью 25 мкм2 не превышало пяти объектов.
Обработку АС М -изобр ажений производили при помощи программного обеспечения для обработки АСМ-данных (ПО «одАСМ», Роспатент, рег. номер № 2010613458, 26 мая 2010 г.), разработанного в ИБМХ. Обычно в растворах белков, несмотря на высокую очистку, присутствуют загрязнения, формирующие пленку на слюде. Высота этой пленки в наших экспериментах составляла в буфере 2,0 ± 0,1 нм. Поэтому данный факт учитывали при обработке АСМ-данных за счет введения уровня отсечения
2,2 нм в буфере. Высоты белковых молекул ВМ3 определяли как высоты соответствующих максимумов ра спределения р(Н) их изображений по высотам аналогично [12,13]:
Nh
p(h) = Nf* 100%,
(2)
где Nh - число визуализированных белков с высот
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.