УДК 579.6:579.26:579.87
АДАПТАЦИОННЫЕ МЕХАНИЗМЫ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ УСТОЙЧИВОСТИ АЛКАНОТРОФНЫХ АКТИНОБАКТЕРИЙ К ИОНАМ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ
© 2013 г. И. Б. Ившина*, **, М. С. Куюкина*, **, Л. В. Костина*
*Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН 614081 Пермь, ул. Голева, 13 ** Пермский государственный национальный исследовательский университет 614990 Пермь, ул. Букирева, 15
e-mail: ivshina@iegm.ru Поступила в редакцию 25.06.2012 г.
Исследована чувствительность культур актинобактерий из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним коллекции ИЭГМ, www.iegm.ru/iegmcol) к воздействию солей тяжелых металлов (ТМ). Обсуждаются возможные механизмы неспецифической резистентности актинобактерий к ТМ, обусловленные их экологической приуроченностью, алка-нотрофией и способностью синтезировать биосурфактанты. Отобраны углеводородокисляющие штаммы с высокой эмульгирующей активностью, устойчивые к повышенным (>250 мМ) концентрациям ТМ.
Ключевые слова: алканотрофные актинобактерии, нефтяные углеводороды, эмульгирующая активность, тяжелые металлы, неспецифическая устойчивость, биосурфактанты.
DOI: 10.7868/S036705971302008X
На фоне кризиса состояния окружающей среды чрезвычайно остро стоит проблема восстановления природных экосистем, загрязненных тяжелыми металлами (ТМ) и нефтяными углеводородами. Перспективным методом очистки биотопов от данных экополлютантов с точки зрения эффективности, безопасности и экономичности считается использование микроорганизмов, обладающих способностью аккумулировать значительные количества ионов ТМ из внешней среды независимо от их участия в метаболических процессах клеток (Пименов и др., 1996). Разработка комплексных технологий очистки экосистем, загрязненных одновременно ТМ и нефтепродуктами, предусматривает использование микроорганизмов с высокой углеводородокисляющей активностью и устойчивых к воздействию ТМ (Костина и др., 2010; СЫгазШй, ^Ыта, 2002). Данная задача требует решения ряда фундаментальных проблем, в частности, выяснения взаимосвязи между систематической принадлежностью микроорганизмов и их способностью к одновременному усвоению углеводородов и аккумуляции ионов ТМ, изучения степени резистентности к ТМ микроорганизмов экологически значимых таксонов в зависимости от показателей их эмуль-
гирующей активности, а также адаптационных механизмов неспецифической устойчивости уг-леводородокисляющих микроорганизмов к ионам ТМ.
В последнее время все большую экологическую значимость приобретают непатогенные но-кардиоформные актинобактерии рода Шойосос-ст, обладающие способностью окислять природные и антропогенные углеводороды. Усвоение углеводородных субстратов сопровождается существенной перестройкой структурно-функциональной организации родококков и формированием устойчивости клеток к неблагоприятным воздействиям (Ившина и др., 1987, 2007). В частности, выявлено повышение антибиотикорези-стентности родококков при культивировании на минеральных средах в присутствии газообразных и жидких н-алканов по сравнению с организмами, растущими на богатых питательных средах (Ившина, Куюкина, 1997; Куюкина и др., 2000). Механизмы устойчивости актинобактерий к ионам ТМ, обусловленные потреблением углеводородных субстратов, ранее не исследовались.
Цель настоящей работы — исследование устойчивости актинобактерий различных таксонов к солям ТМ и механизмов ее формирования в
115
3*
условиях алканотрофного метаболизма бактериальных клеток.
рическими методами с помощью программ Statis-tica v. 6.0 и Excel 2003.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Рабочая коллекция включала 64 штамма акти-нобактерий из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним коллекции ИЭГМ; № 768 во Всемирной федерации коллекции культур; www.iegm.ru/ iegmcol/index.html), принадлежащих к следующим видам: Dietzia maris (5 штаммов), Gordonia ru-bripertincta (5), G. terrae (6), Rhodococcus erythropolis (10), R. fascians (5), "R. longus" (8), R. opacus (7), R. rhodochrous (6) и R. ruber (12), а также 142 му-тантных клона R. ruber ИЭГМ 231, полученных методом неспецифического in vitro Тп5-мутагене-за. Мутагенез осуществляли с использованием транспозомного комплекса EZ::TNTM (KAN-2)Tnp Transposome™ (Epicentre Technologies, США) методом электропорации (Fernandes et al., 2001). Ро-дококки выращивали в мясопептонном бульоне или жидкой минеральной среде RS (Ivshina et al., 1998) с добавлением н-гексадекана в качестве единственного источника углерода и энергии при 28°С в течение 28-120 ч.
В работе использовали соли ТМ: CuSO4 • 5H2O, (CH3COO)2Cd • 2H2O, K2CrO4, (NH4)6Mo7O24 • 4H2O, NiSO4 • 7H2O, Pb(NO3)2, ZnSO4 • 7H2O, VOSO4, NaVO3, Na3VO4 в концентрации от 0.08 до 250.0 мМ. Степень резистентности актинобактерий к ТМ оценивали по минимальной ингибирующей концентрации (МИК), определяемой микролуночным методом (Bell et al., 2004).
Определение эмульгирующей активности бактериальных культур в двухфазной системе н-гек-садекан - вода проводили методом пробирочной пробы (Коронелли, Юферова, 1990) с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-А (22 кГц; 0.7 А). Величину эмульсионного слоя измеряли через 6 мин (Е01), 1 ч (Е1) и 24 ч (Е24). Индекс эмульгирования (Е, %) рассчитывали по отношению высоты эмульсионного слоя к общей высоте столба жидкости в пробирке.
Комплексообразование ионов Ni2+ с Rhodococ-cus-биосурфактантом, полученным как описано ранее (Kuyukina et al., 2001), регистрировали методом ионообменного анализа при измерении констант условной стабильности (КУС) (Ochoa-Loza et al., 2001). Количественное определение Ni2+ в водной фазе осуществляли диметилглиок-симным методом (Лурье, 1984) с использованием двулучевого спектрофотометра Lambda EZ210 (UV/Vis), Perkin-Elmer, США при X = 470 нм.
Эксперименты проводили в 3-5-кратной по-вторности. Статистическую обработку результатов осуществляли традиционными и непарамет-
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Чувствительность актинобактерий к солям ТМ.
Актинобактерии в зависимости от условий культивирования проявляли различную чувствительность к солям ТМ (табл. 1). Все культуры сохраняли способность к росту в присутствии ионов ТМ (показатели МИК варьировали в диапазоне от 0.08 до 250.0 мМ в зависимости от физико-химических свойств ионов ТМ). Использованные ТМ по степени токсического воздействия на исследованные культуры актинобактерий были распределены в ряд Cd2+ > Zn2+ > Ni2+ > Cu2+ > Mo6+ > > Pb2+ > Cr6+ > V5+: наиболее токсичным является кадмий, менее токсичным — хром. Актинобакте-рии отдельных таксонов по степени устойчивости к ионам ТМ расположились в следующий ряд: Rhodococcus > Gordonia > Dietzia, в котором наибольшей степенью резистентности характеризовались представители рода Rhodococcus.
Интересно отметить, что пигментированные актинобактерии обладали наиболее выраженной устойчивостью к ионам ТМ (рис. 1). Так, представители видов D. maris, G. rubripertincta, R. rhodochrous и R. ruber, синтезирующие красно-оранжевый недиффундирующий пигмент, а также R. fascians, образующие ярко-желтые колонии, характеризовались достоверно (p < 0.05) более высокой степенью устойчивости к большинству ТМ (Cd2+,
CrO4-, Cu2+, MoO2-, Ni2+, Pb2+ и Zn2+) по сравнению с актинобактериями видов R. erythropolis, "R. longus" и R. opacus, образующими колонии кремового или палевого цвета. Выявленный факт, по-видимому, свидетельствует о возможном участии пигментов в процессах биологического связывания ионов металлов (Ившина и др., 2002; Gadd, 1990).
В целях углубленного изучения межвидовых и внутривидовых взаимоотношений исследованных актинобактерий по признаку устойчивости к солям ТМ полученные данные были обработаны с помощью кластерного анализа. Приведенная на рис. 2 дендрограмма иллюстрирует распределение коллекционных штаммов по кластерам в зависимости от степени их резистентности к ТМ. Как видно из дендрограммы, штаммы актинобактерий могут быть объединены в три соответствующие группы, имеющие внутригрупповой показатель сходства не выше 90 усл. ед.
Группа А (высоко резистентные к ионам ТМ штаммы) объединяет 19 штаммов актинобакте-рий, принадлежащих преимущественно к родам Dietzia и Rhodococcus. Степень сходства штаммов внутри данной группы довольно высока и составляет менее 10 усл. ед. При этом большинство кол-
2+ , „ * у—т, Cu2+" 20
0.8 0.6 0.4 0.2
0
Cd
12 8 4
0
ш
16 12 8 4
0
/—* H^i
CrO2-
S 15 И10
5
0
20 16 12 8 4 0
VO
2+
80 60 40 20 0
Цвет колоний
10 8 6 4 2 0
Zn
2+
Рис. 1. Устойчивость актинобактерий к ионам ТМ в зависимости от синтезируемого пигмента:
1 — красно-оранжевые (D. maris, G. rubripertincta, R. rhodochrous и R. ruber); 2 —желтые (R. fascians); 3 — кремовые и палевые (R. erythropolis, "R. longus" и R. opacus) колонии; * — статистически достоверно (p < 0.05) отличается от непигмен-тированных актинобактерий.
*
*
3
3
1
2
3
*
6
*
4
2
0
1
лекционных культур синтезируют красно-оранжевый недиффундирующий пигмент, за исключением лишь "R. longus" ИЭГМ 68. Группа Б (чувствительные к ТМ штаммы) состоит из 32 штаммов актинобактерий, преимущественно (на 90%) принадлежащих к роду Rhodococcus (связанных расстоянием до 25 усл. ед.). Группу В (высоко чувствительные к ионам ТМ штаммы) составляют 13 штаммов, демонстрирующие высокую гетерогенность по исследованному признаку (расстояние между штаммами на построенной дендрограмме превышает 80 усл. ед.).
Следует отметить, что строгой корреляции между видовой принадлежностью актинобакте-рий и их устойчивостью к солям ТМ не выявлено. В частности, наблюдалась выраженная гетерогенность по данному признаку представителей G. terrae, R. erythropolis, R. fascians, "R. longus", R. opacus и R. ruber (внутривидовой разброс данных достигал от 2.0 до 62.5 раза), что, по-видимому, обусловлено штаммовой специфичностью исследованных коллекционных культур. Это подтвер-
ждает тот факт, что вопрос о пороговых концентрациях ТМ в объектах окружающей среды должен решаться индивидуально в отношении каждого конкретного бактериоценоза.
Как видно из табл. 1, резистентность актинобактерий, выращенных в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.