ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 413, № 2, с. 271-275
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 576.3
АДАПТАЦИЯ МИКОПЛАЗМ К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ УСЛОВИЯМ РОСТА: НАНОТРАНСФОРМАЦИЯ И ФИТОПАТОГЕННОСТЬ ACHOLEPLASMA LAГОLAWП PG8
© 2007 г. В. М. Чернов, Н. Е. Мухаметшина, Ю. В. Гоголев, Т. Н. Нестерова, О. А. Чернова
Представлено академиком И.А. Тарчевским 14.08.2006 г. Поступило 14.08.2006 г.
Молекулярно-генетические основы адаптации микоплазм к неблагоприятным условиям роста представляют особый интерес. Ограниченные биохимические возможности микоплазм - мельчайших прокариотических организмов, способных к самостоятельному воспроизведению, - не являются препятствием для распространения этих бактерий в различных биоценозах при пер-систенции у высших эукариот и циркуляции в природе. Однако в исследовании соответствующих механизмов сделаны лишь первые шаги [1-4]. Уникальным видом с точки зрения адаптивных способностей микоплазм является ААо1ер^та laidlawii - "вездесущая" микоплазма, обнаруживаемая в почве, компосте, сточных водах, в клеточных культурах, тканях человека, животных и растений [1, 5]. В наших исследованиях [3, 4] было показано, что адаптивные реакции A.laidlawii PG8 к неблагоприятным условиям роста связаны с трансформацией вегетативных форм клеток микоплаз-мы в наноклетки - ультрамикроформы, устойчивые к биотическим и абиотическим стрессорам. Феномен нанотрансформации обнаружен у разных бактерий, а также как ответная реакция микроорганизмов на неблагоприятные условия роста. У некоторых бактерий адаптация к неблагоприятным условиям роста сопровождается изменениями патогенности. Ранее нами [6] было установлено, что неадаптированная к неблагоприятным условиям роста культура A.laidlawii PG8 фитопатогенна: инфицирование растений клетками соответствующей культуры микоплазмы обусловливает развитие фитомикоплазмозов. Выяснение особенностей фитопатогенности адаптированной к неблагоприятным условиям роста культуры A.laidlawii PG8 явилось задачей данного исследования. В результате впервые установлено, что адаптация
культуры микоплазмы к неблагоприятным условиям роста, связанная с трансформацией вегетативных форм клеток в ультрамикроформы (наноклетки), сопровождается изменениями ее фитопатогенности. В работе был использован референтный штамм A.laidlawii PG8, полученный из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи. Для получения культуры A.laidlawii PG8, адаптированной к неблагоприятным условиям роста, использовали метод индукции некультиви-руемого состояния у Salmonella typhimurium [7]. Метод включал культивирование микроорганизмов на среде с ограничением субстрата в течение длительного времени, при этом он был модифицирован в соответствии с особенностями культивирования микоплазм [4]. Из питательной среды Эдварда исключали глюкозу и дрожжевой экстракт и культивировали микоплазмы при дефиците субстрата 480 суток. Выращенные на полноценной среде Эдварда клетки A.laidlawii PG8 в экспоненциальной стадии роста составили соответственно контрольную - неадаптированную к неблагоприятным условиям роста - культуру микоплазмы. Для определения титра КОЕ использовали полужидкую и твердую среду Эдварда с добавлением 0.5 и 1.2% агарозы. Двумерный электрофорез белков, а также выделение, очистку, электрофоретическое разделение и ПЦР-ана-лиз ДНК клеток микоплазм с использованием специфичных праймеров A16LF и A23RF для амплификации нуклеотидных последовательностей оперонов рРНК A.laidlawii PG8 выполняли, как описано ранее в работе [4].
Фитопатогенность клеток адаптированной и неадаптированной к неблагоприятным условиям роста культуры микоплазмы исследовалась на укорененных черенках барвинка малого (Vinca minor L.) - специфичного индикатора фитомикоплазмозов [8]. В контрольные и опытные группы отбирали по 20 растений одинакового размера и возраста укоренения. Растения инфицировали методом Клемента [6]. Для этого в растения вво-
Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской Академии наук
дили соответственно 1 мкл не адаптированной к неблагоприятным условиям роста культуры A.laidlawii PG8 (стационарная фаза роста на полноценной среде) и адаптированной к неблагоприятным условиям роста in vitro культуры микоплаз-мы. В контрольной группе растения инъецировали стерильной питательной средой. Наблюдения за контрольными и опытными растениями осуществляли в течение периода, необходимого для проявления признаков фитомикоплазмоза (6-8 недель). Выявляемые отклонения классифицировали по типам, характерным для микоплазменных инфекций растений [8], - хлороз и аномалии развития побега, а также некроз и увядание листьев.
Электронно-микроскопические исследования клеток микоплазм, культивируемых in vitro, а также тканей растений проводили на электронном микроскопе Hitachi-110 (Япония). Ультратонкие срезы получали на микротоме LKB-III (Швеция). Материал фиксировали глутаровым альдегидом (2.5%), приготовленным на фосфатном буфере (0.1М, pH 7.2), в течение 12 ч. Затем материал обезвоживали ацетоном и выдерживали в 0.1% OsO4, приготовленном на том же буфере, с добавлением 34 мг/мл сахарозы.
Статистический анализ данных проводили с применением стандартных математических методов (расчет среднеквадратического отклонения, сравнение средних по критерию Стьюдента), используя программу Microsoft Excel-2000. Критерий вероятности P < 0.05 принимали достаточным для достоверной разницы опытной и контрольной групп данных. Несколько сравниваемых выборок, полученных в экспериментах, анализировали с помощью метода дисперсионного анализа (ANOVA) [9]. Сравнение частоты выявления морфологических отклонений у контрольных и опытных растений V.minor L. проводили с учетом требований, предъявляемых для анализа малочисленных выборок. Выборки соответствовали нормальному распределению, так как эксперименты проводили с генетически однородным материалом - растениями, полученными в результате вегетативного размножения, - и для их сравнения использовали стандартные параметрические критерии [10; www.statsoft.ru/stbasic.html].
В результате длительного культивирования клеток A.laidlawii PG8 на обедненной среде получена адаптированная к неблагоприятным условиям роста in vitro культура микоплазмы. Клетки адаптированной культуры микоплазмы - ультра-микроформы - имели размер менее 0.2 мкм и обладали морфологическими, ультрацитоструктур-ными и молекулярно-генетическими свойствами, отличающими их от типичных - вегетативных форм клеток A.laidlawii PG8 [4]. Ультрамикро-формы A.laidlawii PG8 проявляли выраженную резистентность к стрессорным факторам, дли-
тельно сохраняли жизнеспособность в неблагоприятных для роста условиях, были способны восстанавливать пролиферативную активность и реверсировать в исходную вегетативную форму. При сравнении данных двумерного электрофореза в полипептидных спектрах клеток адаптированной и неадаптированной культур A.laidlawii PG8 - ультрамикроформ и вегетативных форм -были выявлены существенные различия. У ультрамикроформ микоплазмы не обнаруживались 42 полипептида, присутствующих у вегетативных форм A.laidlawii PG8, однако оказалось не менее 26 полипептидов, не регистрируемых у вегетативных форм (рис. 1). Полученные данные свидетельствуют о существенной реорганизации экспрессии генома A.laidlawii PG8 при нанотранс-формации - превращении вегетативных форм клеток в ультрамикроформы.
Реорганизация генома у бактерий, связанная с адаптацией их к неблагоприятным условиям роста, обусловливается ДНК-связывающими белками [11]. Эти белки не разрушаются при фе-нольной экстракции, но чувствительны к обработке протеиназой К [2]. В этой связи при использовании матричной ДНК без специальной очистки может наблюдаться обратимый эффект аттенуации ПЦР-сигнала в отношении некоторых амплифицируемых участков генома микроорганизмов. Подобный эффект был обнаружен нами при амплификации двух различающихся по первичной структуре оперонов рРНК A.laidlawii PG8 в случае диссоциации в популяции клеток культуры микоплазмы, связанной с ее адаптацией к неблагоприятным условиям роста [4].
В геноме A.laidlawii гены рРНК представлены двумя оперонами - ггпА и ггпВ. В спейсерной области 16S-23S оперона ггпА присутствует вставка (210 пар нуклеотидных оснований), содержащая два гена тРнК (изолейцин и аланин). Нами были синтезированы праймеры A16LF и A23LR для амплификации нуклеотидных последовательностей как спейсеров, так и примыкающих к ним фрагментов кодирующих зон генов 16S и 23S рРНК A.laidlawii. При использовании этих праймеров в ПЦР с ДНК лизатов клеток двух морфотипов A.laidlawii PG8 у ультрамикроформ микоплазмы была обнаружена избирательная амплификация нуклеотидной последовательности одного оперона рРНК - ггпВ. При этом ферментативная депротеи-низация ДНК клеток A.laidlawii PG8 приводила к отмене эффекта аттенуации амплификации фрагмента ггпА оперона рРНК у ультрамикроформ (рис. 2). В результате электрофоретического разделения в ПаАг белков, полученных из спиртовых осадков ДНК клеточных лизатов после фенольной депротеинизации, нами были выделены белки, специфичные для ультрамикроформ (80, 37 кДа) и вегетативных форм (48, 34, 25 кДа) клеток микоплазмы.
Рис. 1. Электрофореграммы полипептидов "типичных" клеток А.ЫШа-га РС8 (а) и ультрамикроформ (б). Стрелками указаны полипептиды, по которым клетки субпопуляций различаются.
ДНК-связывающие белки, определяющие специфичные изменения топологии ДНК, участвуют в процессах реорганизации экспрессии генома бактерий, обусловливающих изменения клеточной физиологии, метаболизма [12] и вирулентности микроорганизмов [13, 14]. В наших исследованиях также было обнаружено, что адаптация культуры микоплазмы к неблагоприятным условиям роста in vitro, связанная с трансформацией вегетативных форм клеток в ультрамикрофор-мы, сопровождается изменением ее фитопатоген-ного потенциала.
В результате наблюдения за растениями контрольной и опытной групп нами было установлено, что адаптированная к неблагоприятным условиям роста культура A.laidlawii PG8 по сравнению с неадаптированной культурой микоплазмы является
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.