научная статья по теме АДАПТАЦИЯ МИКОПЛАЗМ К СТРЕССОВЫМ УСЛОВИЯМ: ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕНИЙ ПРОТЕОМА У MYCOPLASMA HOMINIS PG37 ПРИ ГОЛОДАНИИ И ПОНИЖЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ СРЕДЫ Биология

Текст научной статьи на тему «АДАПТАЦИЯ МИКОПЛАЗМ К СТРЕССОВЫМ УСЛОВИЯМ: ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕНИЙ ПРОТЕОМА У MYCOPLASMA HOMINIS PG37 ПРИ ГОЛОДАНИИ И ПОНИЖЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ СРЕДЫ»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, том 45, № 5, с. 914-923

= ПРОТЕОМИКА

УДК 579.8.05

АДАПТАЦИЯ МИКОПЛАЗМ К СТРЕССОВЫМ УСЛОВИЯМ: ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕНИЙ ПРОТЕОМА У Mycoplasma hominis PG37 ПРИ ГОЛОДАНИИ И ПОНИЖЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ СРЕДЫ

© 2011 г. В. М. Чернов*, О. А. Чернова, Н. Б. Баранова, О. В. Горшков, Е. С. Медведева, Г. Ф. Шаймарданова

Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук, Казань, 420111 Поступила в редакцию 04.02.2011 г.

Принята к печати 10.03.2011 г.

Mycoplasma hominis — одна из наиболее распространенных микоплазм (класс Mollicutes), ассоциированных с социально-значимыми заболеваниями человека и контаминацией клеточных культур. Решение проблемы контроля инфекций, вызываемых M. hominis, связывают с пониманием молекулярных механизмов, определяющих выживание бактерии в неблагоприятных условиях среды. При помощи протеомного подхода (2-DIGE и MALDI TOF/TOF MS) впервые выявлены 53 белка M. hominis PG37, количественное содержание которых различается у микоплазм, культивируемых в оптимальных и стрессовых (голодание и пониженная температура среды) условиях. Согласно классификации по функциональным категориям (clusters of orthologous groups of proteins — COG), 47 из 53 белков микоплазмы участвуют в ключевых процессах — трансляции (12; 22.64%), транскрипции (2; 3.77%), посттрансляционной модификации (7; 13.20%), регуляции клеточного цикла (2; 3.77%), образовании энергии (6; 11.32%), транспорте и метаболизме углеводов (3; 5.66%), аминокислот (8; 15.09%), нуклеотидов (6; 11.32%), неорганических ионов (1; 1.89%). Функции шести белков (11.32%) не установлены; 24 белка (45.28%) относятся к факторам вирулентности. Белки M. hominis PG37, уровень которых изменяется в неблагоприятных условиях, связаны с адаптацией микоплазмы к стрессорам и служат потенциальными мишенями контроля инфекций, вызываемых этой бактерией.

Ключевые слова: Mycoplasma hominis PG37, адаптация к стрессовым условиям, 2D-электрофорез, масс-спектрометрия, белковый профиль.

THE ADAPTATION OF MYCOPLASMAS TO STRESS CONDITIONS: FEATURES OF PROTEOME SHIFT IN Mycoplasma hominis PG37 UNDER STARVATION AND LOW TEMPERATURE, by V. M. Chernov*, O. A. Chernova, N. B. Baranova, O. V. Gorshkov, E. S. Medvedeva, G. F. Shaymardanova (Institute of Biochemistry and Biophysics, Russian Academy of Sciences, Kazan, 420111 Russia; *e-mail: chernov@mail.knc.ru). Mycoplasma hominis — one of the widely spread mycoplasmas (class Mollicutes), associated with the socially significant human diseases and contamination of cell cultures. The solution of the problem on controlling M. hominis infections is connected with determination of the molecular basis, responsible for mechanisms of bacterium survival under unfavorable conditions. As a result of proteomic approach (2-DIGE and MALDI TOF/TOF MS) for the first time, 53 M. hominis PG37 proteins were detected, different abundance of which occurred at cultivating the bacterium under stress (starvation and low temperature) conditions. According to the classification of proteins by functional category (clusters of orthologous groups of proteins — COG), 47 of the 53 proteins of the mycoplasma are involved in the fundamental cellular and biochemical processes — translation (12; 22.64%), transcription (2; 3.77%), posttranslational modification (7; 13.20%), cell cycle control (2; 3.77%), energy production and conversion (6; 11.32%), carbohydrate transport and metabolism (3; 5.66%), amino acid transport and metabolism (8; 15.09%), nucleotide transport and metabolism (6; 11.32%), inorganic ion transport and metabolism (1; 1.89%). The functions of six proteins (11.32%) have not been found; 24 proteins (45.28%) are the factors of bacterium virulence. M. hominis PG37 proteins, the expression modulation of which arises under the unfavorable environmental conditions, are the components of adaptation mechanisms of the mycoplasma to the stressors and potential targets for controlling infections caused by this bacterium.

Keywords: Mycoplasma hominis PG37, adaptation to stress conditions, two-dimensional gel electrophoresis, mass spectrometry, protein profile.

Принятые сокращения: УМФ — ультрамикроформы; МВ — мембранные везикулы; COG — clusters of orthologous groups of proteins (кластеры ортологичных групп белков); CHAPS — 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamonio]-1-propanesulfonate (3-[(3-холами-допропил) (диметиламмоний]-1-пропансульфонат).

* Эл. почта: chernov@mail.knc.ru

Mycoplasma hominis — одна из наиболее распространенных микоплазм (класс Mollicutes), ассоциированных с социально-значимыми заболеваниями человека и контаминацией клеточных культур [1, 2]. В организм человека M. hominis может проникать как вертикальным — от матери к плоду, так и горизонтальным — контактным — путями [1—4], и вызывать развитие острых и хронических урогениталь-ных инфекций аппарантного и инаппарантного типов, обусловливающих осложнения беременности, патологию и гибель плода [2—4]. Источником заражения клеточных культур M. hominis служит персонал лаборатории, реактивы и оборудование, лабораторная посуда и т.д. [1], что предполагает возможность выживания микоплазмы вне организма человека с сохранением вирулентных свойств — ин-фекционности, токсигенности и персистенции. Сравнительно недавно появились сведения о способности M. hominis существовать в условиях, значительно отличающихся от основной среды обитания бактерии, — при пониженной температуре, а также при ограничении питательных веществ и источника энергии (голодание) [5—7]. Эти данные свидетельствуют о значительном адаптивном потенциале микоплазмы и широком спектре возможных путей заражения ею человека.

Подавление инфекций, вызываемых M. hominis, представляет серьезную проблему, решение которой предполагает выяснение молекулярных основ персистенции микоплазмы, связанных с факторами, определяющими как восприимчивость к M. hominis, так и выживание бактерии в неблагоприятных условиях среды [1, 4, 8]. Определение в 2009 году полной нуклеотидной последовательности генома M. hominis PG21 [9] обеспечило возможность использования постгеномных технологий для выявления белков и генов, вовлеченных в адаптацию бактерии к стрессорам. Однако сообщения о проведении соответствующих исследований отсутствуют. Задача данной работы — сравнительный анализ протеома клеток M. hominis PG37 в оптимальных и стрессовых (понижение температуры среды и голодание) условиях.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Культивирование клеток микоплазмы. В работе использован штамм M. hominis PG37, полученный из коллекции микроорганизмов Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (РАМН, Москва). Клетки M. hominis PG37 выращивали в оптимальных условиях — при 37°С в жидкой питательной среде Эдварда (1.5% триптозы, 0.2% HEPES, 5% дрожжевого экстракта, 10% сыворотки крови лошади, 1% аргинина, 0.2% пенициллина (1000 ед/мл), 0.003% фенолового красного) согласно [1]. Для получения культуры M. hominis PG37, адаптированной к неблагоприятным условиям, — голоданию и пониженной температуре (30°С), ис-

пользовали описанный ранее метод [10, 11], модифицированный в соответствии с особенностями роста этой микоплазмы [1]. Для этого из питательной среды Эдварда исключали сыворотку, дрожжевой экстракт и аргинин (основный источник энергии микоплазмы). Выращенную на полноценной питательной среде Эдварда культуру M. hominis PG37 (середина логарифмической фазы роста) подвергали холодовому шоку (8°С в течение 2 ч) для быстрой остановки экспоненциального роста и, соответственно, предотвращения стрессовых условий, характерных для поздней логарифмической фазы роста [12]. Клетки собирали центрифугированием (5500 g, 8°С, 30 мин), осадок суспендировали в ограниченной по составу среде (1.5% триптозы, 0.2% HEPES, 0.2% пенициллина (1000 ед/мл)), объем которой в 4 раза превышал объем полноценной среды, на которой были выращены клетки мико-плазмы, и инкубировали в течение 28 нед при пониженной температуре среды (30°С). Клетки M. hominis PG37, инкубированные в неблагоприятных условиях, составили опытную группу, а в оптимальных — контрольную.

Выделение, дифференциальная окраска и разделение белков с помощью двумерного электрофореза. Культуру клеток M. hominis PG37 центрифугировали в течение 20 мин при 18514 g; осадок промывали, центрифугируя 2 раза в буфере, содержащем 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис, 2мМ MgCl2 ■ 6H2O, pH 7.4, при 18514 g в течение 20 мин, а затем в том же буфере с добавлением ингибитора протеаз PMSF ("Fluka") при 18514 g в течение 20 мин и хранили при —84°С. Перед проведением 2D-электрофореза осадок клеток M. hominis PG37 обрабатывали смесью нуклеаз ("Amersham"). Белки растворяли в буфере, содержащем 8 М мочевину, 2 М тиомочевину, 2% амфолинов (рН 3—10), 80 мМ дитиотреитол (ДТТ), 16.7% раствора (30% СHAPS ("Amersham") и 10% NP 40). Образцы центрифугировали в течение 15 мин при 13000 g. Концентрацию белка в образцах измеряли по методу Брэдфорд с помощью Quick Start Bradford Dye Reagent ("Bio-Rad"). Белки метили цианинами CyDye3-DIGE (зеленая флуоресценция) и CyDye5-DIGE (красная флуоресценция) согласно рекомендациям фирмы-изготовителя ("Amersham"). После остановки реакции с помощью 10 мМ раствора лизина добавляли ДТТ до концентрации 100 мМ и амфолины (рН 3—10) до концентрации 1%.

Изоэлектрофокусирование проводили в 4%-ном полиакриламидном геле в стеклянных восемнадцатисантиметровых трубочках. Использовали следующие реактивы: вода для хроматографии ("Merck"), 8 М мочевина, 4%-ный акриламид/метиленбиса-криламид, 1.75% амфолины (рН 3—10), 3.5% амфолины (рН 5-8), 6% раствора 30% CHAPS, 10% NP 40, 0.1% ТЕМЕД, 0.02% персульфат аммония ('Amersham"). Фокусирование осуществляли в следующем режиме: 100 V-200 V-300 V-400 V-500 V-600 V -

по 45 мин, 700 V - 10 ч, 900 V - 1-2 ч. После завершения изоэлектрофокусирования трубочки уравновешивали в течение 30 мин в буфере, содержащем 6 М мочевину, 30% глицерина, 62.5 мМ Трис-HCl (pH 6.8) ("Amersham"), 2%-ный додецилсуль-фат натрия ("Bio-Rad"), бромфеноловый синий ("Sigma") и 20 мМ ДТТ Затем труб

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком