ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 1, с. 59-64
УДК 577.114:581.143:579.67
АДГЕЗИЯ Bacillus subtilis НА ПОВЕРХНОСТИ ПЕКТИН-КАЛЬЦИЕВЫХ ГЕЛЕЙ
© 2015 г. Е. А. Гюнтер, А. К. Мелехин
Институт физиологии Коми НЦУрО РАН, Сыктывкар, 167982 e-mail: gunter@physiol.komisc.ru Поступила в редакцию 30.06.2014 г.
Пектин-кальциевые гели, полученные из пектинов каллусных культур, в различной степени способны адгезировать на своей поверхности клетки грамположительных бактерий Bacillus subtilis, что определяется особенностями строения пектинов. Быстрая адгезия клеток на геле, полученном из пектина каллусной культуры Tanacetum vulgare (TVC) связана с высоким содержанием линейной области в углеводной цепи пектина, высокой молекулярной массой и низкой степенью метилэтери-фикации пектина. Число адгезированных клеток на поверхности гелей, полученных из пектинов каллусных культур Silene vulgaris (SVC), TVC, и Lemna minor (LMC) после 8 ч инкубации было близким, тогда как на геле из пектина каллуса Silene tatarica (STC), их количество было минимальным, что связано с более высокой степенью метилэтерификации пектина STC (45%) по сравнению с другими пектинами (4—12%). Константа скорости адгезии (k) B. subtilis для геля TVC в течение первых 120 мин была наибольшей по сравнению с другими гелями, значение k для гелей SVC, STC и LMC было сходным. Наименьший уровень k характерен для геля из коммерческого яблочного пектина. Полученные данные могут быть использованы для получения гелей с адгезивными и антиадгезивными свойствами.
DOI: 10.7868/S0555109915010055
Пектины как нетоксичные и биодеградируемые полимеры в связи с их высокой физиологической активностью (иммуномодулирующей, противоязвенной, антитоксической, противоопухолевой) и способностью к гелеобразованию широко используются в фармацевтической и пищевой промышленности [1]. В настоящее время проводятся исследования по использованию пектинов в виде гидрогелей для систем направленной доставки лекарств в организме [2]. Пектины представляют собой галактуронаны и рассматриваются, как полимеры D-галактуроновой кислоты, которые имеют линейные области галактуронана и рамнога-лактуронана (smooth regions), а также разветвленные области (hairy regions), представленные рамногалактуронаном I и рамногалактуронаном II (RGI и RGII), с боковыми цепями из галактана, арабинана, арабиногалактанов и других более сложных фрагментов [1, 3]. Остатки D-галактуро-новой кислоты основной цепи галактуронана частично метилэтерифицированы. Пектины с низкой степенью этерификации содержат менее 50% метилэтерифицированных остатков D-галакту-роновой кислоты [1, 3]. Такие пектины формируют гели в присутствии ионов кальция, при этом происходит кросс-связывание молекул пектина ионами кальция. Структура агрегированных цепей в пектиновом геле описывается моделью "яйцо в решетке" ("egg-box"), в которой соединяемые сегменты находятся на одинаковых цепях, и
зоны спаривания образованы цепями галактуронана, а ионы кальция при этом размещаются в пространстве между соседними спиральными цепями полисахаридов, подобно яйцу в решетке, образуя комплексы с атомами кислорода [1]. Ключевыми факторами, влияющими на формирование геля и его функциональные свойства, являются структурные характеристики пектина (длина углеводных цепей, молекулярная масса, разветвлен-ность полисахарида, степень метилэтерификации карбоксильных групп остатков галактуроновой кислоты, степень ацетилирования), а также наличие ионов кальция, количество пектина, рН и температура [4].
Изучение пектиновых гелей представляет особый интерес в связи с проблемой создания новых функциональных материалов. Получение данных, необходимых для создания новых функциональных биоматериалов на основе пектиновых гелей с сорбционными, антиадгезивными, супергидрофобными и другими ценными свойствами актуально для фармацевтической промышленности и др. отраслей.
Бактерии способны адгезироваться на различных видах поверхностей и формировать гетерогенные многоклеточные структуры, названные биопленками [5, 6]. Адгезия бактерий зависит от таких характеристик поверхности бактериальных клеток, как гидрофобность, ^-потенциал, тип экс-
трацеллюлярных полимеров (липополисахариды), присутствие фимбрий и протеинов [6]. Различные виды бактерий и штаммы адгезируются в разной степени вследствие различающихся физико-химических характеристик бактерий [7]. Свойства поверхности субстрата такие, как гидрофобность, Z-потенциал, рельеф поверхности, также имеют значение для бактериальной адгезии [6, 7].
Очевидно, что полисахариды, полученные биотехнологическим путем, существенно различающиеся своим строением, будут формировать гели с различными адгезивными свойствами. В настоящей работе для получения гидрогелей были использованы пектины каллусных культур Silene vulgaris, Silene tatarica, Tanacetum vulgare и Lemna minor, обладающие иммуномодулирующей [8], адъювантной [9] и противовоспалительной активностью [10]. Для изучения адгезивных свойств гелей использовали грамположительную бактерию Bacillus subtilis, имеющую гидрофобную поверхность и являющуюся антагонистом патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Штаммы B. subtilis входят в состав ряда лекарственных препаратов (пробиотиков), пищевых добавок, препаратов для ветеринарии и сельского хозяйства.
Цель работы — определение способности гидрогелей, полученных из пектинов каллусных культур, адгезировать на своей поверхности клетки грамположительной бактерии Bacillus subtilis.
МЕТОДИКА
Условия культивирования каллусных культур.
Каллусные культуры смолевки обыкновенной Silene vulgaris (M.) G., смолевки татарской Silene tatarica L., пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare L. и ряски малой Lemna minor L. выращивали на агаризованной модифицированной среде Му-расиге и Скуга [11]. Культивирование каллусных культур смолевки обыкновенной, татарской и ряски малой осуществляли на среде с добавлением 1.0 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), и 0.5 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП). Каллус пижмы обыкновенной культивировали на среде с 2,4-Д (1.5 мг/л) + БАП (0.5 мг/л). Каллусы выращивали при температуре 26 ± 1°С в темноте субкультивировали с интервалом 21 сут (смолевка обыкновенная и смолевка татарская) и 28 сут (пижма обыкновенная и ряска малая).
Выделение полисахаридов. Перед выделением полисахаридов каллусную ткань S. vulgaris, S. tatarica, T. vulgare и L. minor разрушали путем однократного замораживания—оттаивания. Сырье исчерпывающе экстрагировали в аппарате Сокслета органическими растворителями (метанолом и хлороформом) для удаления низкомолекулярных примесей. Пектиновые полисахариды из воздушно-сухого остатка биомассы выделяли, как опи-
сано в работе [12]. В результате из каллусных культур были получены следующие пектины: SVC из смолевки обыкновенной, STC из смолевки татарской, TVC из пижмы обыкновенной и LMC из ряски малой.
Общие аналитические методы. В полисахарид-ных фракциях определяли содержание гликуроно-вых кислот по реакции с 3,5-диметилфенолом в присутствии концентрированной серной кислоты [13], содержание белка — методом Лоури. Общее содержание углеводов устанавливали по реакции с фенолом в присутствии серной кислоты [14]. Спектрофотометрические измерения проводили на приборе СФ-103 ("Аквилон", Россия).
Степень метилэтерификации определяли по ранее описанному методу [15]. ГЖХ проводили на приборе Hewlett-Packard 4890А ("Hewlett-Packard", США) с пламенно-ионизационным детектором и интегратором НР 3395А на капиллярной колонке RTX-1 (0.25 мм х 30 м) ("Restek", США), газ-носитель — аргон. Средневесовую (Mw) и среднечисловую (Mn) молекулярную массу полисахаридов определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, которую проводили, как описанно ранее [16]. Образец (2—3 мг) растворяли в 1.0 мл 0.15 М раствора NaCl в бидистиллированной воде и фильтровали. Для анализа использовали хроматографическую систему: насос SD-200 ("Dynamax", США), колонку Shodex Asahipak GS-620HQ (7.6 мм х 30 см) ("Shi-madzu", Япония) и предколонку Shodex GS-26 7B (7.6 мм х 5 см) ("Shimadzu", Япония), термостат СТО-10AS и детектор-рефрактометр RID G136A той же фирмы. Элюирование проводили 0.15 М NaCl при 40°C со скоростью потока 0.5 мл/мин. Для калибровки колонки использовали декстран-сульфаты с молекулярными массами 36—50, 400— 600 и 1400 кДа ("Sigma", США).
Полный кислотный гидролиз. Полисахаридные фракции (по 2.0—2.5 мг) гидролизовали 2 М три-фторуксусной кислотой (1 мл) при 100°C в течение 4 ч. Затем гидролизаты упаривали в вакууме с метиловым спиртом до полного удаления трифтор-уксусной кислоты. В качестве внутреннего стандарта использовали миоинозит (0.5 мг/мл). Моносахариды идентифицировали с помощью ГЖХ в виде соответствующих ацетатов полиолов [17].
Получение пектин-кальциевых гелей. Для получения гидрогелей были использованы пектины SVC, STC, TVC и LMC с низкой степенью метилэтерификации (3.5—45%), выделенные из каллусных культур. Гели были также получены из коммерческого яблочного пектина AP (AU 701, "Herbstreith & Fox", Германия) со степенью метилэтерификации 36—44%.
Гели получали методом ионотропного желиро-вания, который был описан ранее [18, 19]. Пектины (20 мг) растворяли в дистиллированной воде
(1 мл), затем раствор пектина (100 мкл) вносили в лунку планшета, добавляли 0.34 М раствор хлорида кальция (100 мкл) и инкубировали в течение 10 мин при 24°C. Остаток раствора хлорида кальция пипеткой удаляли с поверхности геля. Полученные гели стерилизовали с помощью УФ-облучения в течение 30 мин. Из каждого типа пектина было приготовлено по 20 пектин-кальциевых гелей.
Получение бактериальной суспензии. Грампо-ложительные бактерии Bacillus subtilis 149-3 (Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, Москва) выращивали в пробирках на мясо-пептонном агаре (МПА) при 37°C в течение 7 сут Затем культуру смывали с поверхности агара стерильной дистиллированной водой и получали суспензию клеток и спор, которую вносили в колбу Эрленмейера с мясо-пептонным бульоном (250 мл) и культивировали при 37°C на качалке в течение 2 сут.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.