ш
УДК 577.112.083:612.11
АФФИННЫЕ ГЕМОСОРБЕНТЫ НА ОСНОВЕ АРОМАТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ ДЛЯ СВЯЗЫВАНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ КЛАССА G
© 2015 г. П. А. Левашов*, **, #, Е. Д. Овчинникова*, Д. А. Фрид*, А. А. Азьмуко*, М. И. Афанасьева*, Т. И. Коткина*, О. И. Афанасьева*, И. Ю. Адамова*, С. Н. Покровский*
*ФГУ "Российский кардиологический научно-производственный комплекс"Министерства здравоохранения
и социального развития Российской Федерации, 121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, 15а **Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 3 Поступила в редакцию 30.12.2014 г. Принята к печати 12.01.2015 г.
Получены гемосовместимые аффинные сорбенты на основе полисахаридной матрицы и лигандов — пептидов 'У 'ТУ ''КУ связывающие иммуноглобулины О человека (1бО). Проведено сравнение характеристик сорбентов по связыванию как общего 1§О так и подклассов 1§О. Обнаружено, что все новые сорбенты имеют хорошие характеристики по удалению 1§О из плазмы крови, но сорбент на основе WNY в полтора раза эффективней остальных связывает 1§О подкласса 3 (1§О3). Определены физико-химические характеристики процесса связывания 1§О. Для сорбентов на основе пептидов 'У, 'ТУ, WNY константы десорбции 1§О составили 10 ± 3, 28 ± 4 и 13 ± 3 мкМ. Максимальная расчетная сорбционная емкость по 1§О составила 43 ± 2, 45 ± 3 и 46 ± 3 мг 1§О на 1 мл сорбента. Показана гемосовместимость сорбентов, пригодность для медицинского использования.
Ключевые слова: ^О, ^03, иммуноглобулины, аффинный сорбент, триптофилтирозин, триптофил-треонилтирозин, триптофиласпарагинилтирозин, Тгр-Туг, Тгр-Ткг-Туг, Тгр-Лж-Туг.
Б01: 10.7868/80132342315040089
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы появились новые высокоэффективные сорбенты медицинского назначения на основе пептидов, содержащих ароматические аминокислоты, способные связывать 1§О [1—9]. Большой интерес представляют короткие ди- и трипептиды, имеющие в своем составе триптофан и тирозин, которые, несмотря на их малый размер, демонстрируют хорошую лигандную селективность при сорбции 1§О [3—5]. Подобные лиганды в силу своей низкой стоимости и биологической безопасности могут быть исключительно перспективны для создания сорбентов медицинского назначения.
В наших предыдущих работах было показано, что среди коротких ароматических пептидов в качестве лигандов для создания эффективного сорбента хорошо подходят 'У и 'ТУ с незащищенной карбоксильной группой тирозина [4, 5]. Остатки триптофана (' и тирозина (У) присутствуют в стрептококковом протеине О в области связывания домена В1 с константной частью че-
# Автор для связи (тел: +7 (926) 30-35-014; факс: +7 (495) 9395-417; эл. почта: levashov@yahoo.com).
ловеческого 1§О [10]. Наличие треонина (Т), хоть и усложняет структуру, но также приближает ли-ганд к строению участка связывания иммуноглобулинов у природного протеина О, где данный остаток также имеется именно в составе мотива 'ТУ [10]. Следует отметить, что сочетание остатков ТУ само по себе нередко встречается в лиган-дах, способных связывать 1§О [9]. Незащищенная карбоксильная группа также, вероятно, важна для эффективного связывания 1§О, так как в природном белке О рядом с участком, содержащим остатки триптофана ('43), треонина (Т44) и тирозина (У45) располагается петля с остатком глутамино-вой кислоты (Е27), экспонирующим свою карбоксильную группу в область контакта с 1§О [10].
Мы в настоящей работе взяли за основу наиболее удачные пептиды из предыдущих исследований ('У и 'ТУ), а также предложили для сравнения новый пептид WNY, который, на наш взгляд, может быть схож в свойствах с 'ТУ, ввиду особенностей стерических характеристик и полярности остатков аспарагина и треонина.
Отдельной серьезной задачей является создание сорбентов, совместимых с цельной кровью, пригодных для гемосорбции. Лиганды в составе
4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 1§(М, кДа)
Рис. 1. Определение размеров пор для полимерной матрицы "ЭДэгкВеа^ 200 гельпроникающей хроматографией. Зависимость коэфициента доступности С&Тау) от десятичного логарифма молекулярной массы.
гемосорбентов не должны представлять риска для взаимодействия с клетками крови, поэтому использование небольших пептидов может быть хорошим вариантом [11, 12]. Кроме того имеется множество требований к форме и размеру гранул сорбента, который будет безопасен для клеток крови [13, 14]. В нашей работе для создания гемо-совместимых сорбентов выбрана полисахаридная матрица на основе агарозы с заданными размера-
ми частиц и внутренних пор. В конечном итоге совокупность характеристик гемосорбента определяется правильностью и удачностью выбора всех компонентов системы: матрицы, лиганда и соединяющего их молекулярного спейсера.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Подобранная нами матрица имела внутренние поры, доступные для глобулярных белков размером не более 700 кДа, что было определено при помощи гельпроникающей хроматографии (рис. 1). Неспособность более крупных макромолекуляр-ных комплексов проникать в поры хроматографи-ческого материала служит дополнительному улучшению специфичности сорбции целевого компонента (1§С), коэффициент доступности для которого (глобулярные белки массой 150—160 кДа) составил не менее 0.4.
При синтезе сорбентов, созданных на основе выбранной матрицы и пептидов WTY и WNY (рис. 2), на агарозную матрицу присоединяются сначала аминогруппы в составе радикала амино-гексила, затем лиганд (пептид) присоединяется к аминированной матрице конденсацией с глутаро-вым альдегидом с последующим восстановлением основания Шиффа [3, 5]. Углеводородные остовы аминогексила и глутарового альдегида становятся основой гибкого молекулярного спейсера, соединяющего лиганд с матрицей. Количество иммоби-
Рис. 2. Схематическое изображение структур WY-, WTY- и WNY-сорбентов, образуемых при соединении с матрицей соответствующих пептидов-лигандов.
АФФИННЫЕ ГЕМОСОРБЕНТЫ НА ОСНОВЕ АРОМАТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ
555
30
3 20 «
Я ю £10 С
Сорбция 1§О Сорбция общего белка Селективность
1
I
100
75 ^
ть
с о н в
тив
к е л
е Се
50
25
WY
WTY
WNY 1§-Адсопак
0
14
я л е
г12
10
о 8 и н
Й 6 3
я4
в
С
Да
М
А
1§О1 1§О2 1§О3 1§О4
а
Дп.
WY
WTY
WNY 1§-Адсопак
Рис. 3. Емкость и селективность WY-, WTY- и WNY-сорбентов (обозначены на оси абсцисс соответствующими лигандами) в сравнении с сорбентом на основе поликлональных антител (^-Адсопак). Удаление общего белка и 1яО. Селективность рассчитана как отношение количества удаленного к количеству удаленного общего белка (мг/мг).
лизованного на полимернои матрице лиганда для WTY и составило соответственно 32 ± 4, 30 ± 4 и 34 ± 4 мкмоль на 1 мл геля.
Из результатов по связыванию 1§О и общего белка из плазмы крови (рис. 3) видно, что все синтезированные сорбенты превосходят сорбент с моноспецифическими поликлональными антителами (1§-Ддсопак) по эффективности связывания 1§О, и их селективность не намного ниже, чем у 1§-Ддсопака. и ^^^-сорбенты несколько
превосходят по селективности сорбент с ^ГУ
Важной характеристикой для медицинских сорбентов является способность связывать 1§О определенного подкласса. Как видно из рис. 4, WNY-сорбент в полтора раза эффективнее, чем сорбенты с WY и WTY, удаляет 1§О подкласса 3 (1§О3). Известно, что именно 1§О3 могут быть патогенными при ряде аутоиммунных заболеваний [15, 16], поэтому данное преимущество у лиганда WNY является весьма существенным.
Для определения физико-химических параметров связывания были проведены эксперименты с использованием препарата очищенного 1§О. Изотермы сорбции 1§О для сорбентов (рис. 5) хорошо описываются уравнением Ленгмюра (^ = = £мах[1§О]/(К + [^О]), где S — количество связанного с матрицей 1§О, Кй — константа десорбции 1§О, ¿тах — максимальная сорбционная емкость). Из экспериментальных данных можно рассчитать такие параметры, как константу десорбции 1§О и максимальную сорбционную емкость по 1§О. Расчетная максимальная сорбционная емкость для сорбентов с пептидами WY, WTY, WNY
Рис. 4. Удаление WY-, WTY- и WNY-сорбентами иммуноглобулинов О подклассов 1—5.
составляет, соответственно, 42 ± 2, 45 ± 3, 46 ± 3 мг 1§О на 1 мл сорбента. Константы десорбции 1§О для сорбентов с WY, WГY и WNY составили 10 ± 3, 28 ± 4 и 13 ± 3 мкМ соответственно. и WNY-сорбенты имеют параметры связывания 1§О несколько лучше, чем у WГY-сорбента, что однако не мешает использовать и его для эффективной сорбции 1§О из плазмы, как было показано ранее (рис. 3).
В таблице даны результаты испытания сорбента с образцом крови человека. Как видим, контакт с хроматографическим материалом не повреждает форменные элементы крови. Незначительное изменение параметров можно объяснить эффектом разведения образца крови после контакта с сорбентом, который предварительно промыт забуференным физиологическим раствором.
30 -
° 20 ад 20
нч
=к 3
н
н а10
^
я в С
24 [!бО], мг/мл
Рис. 5. Изотермы сорбции на WY- (1), WTY- (2) и WNY-сорбенте (3).
2
0
0
6
0
Показатели крови после контакта с WNY-сорбентом
Показатель Кровь после пропускания через гемосорбент Кровь после пропускания через инертную матрицу Кровь до хроматографии
Лейкоциты (109 кл/л) 4.1 3.9 5.4
Эритроциты (1012 кл/л) 3.5 3.4 4.7
Гематокрит, % 28 29 40
Средний объем эритроцита, фл 86 86 86
Гетерогенность эритроцитов (ширина распределения), % 10.3 9.8 10.5
Среднее содержание гемоглобина в эритроците, пг 28.4 28.0 28.7
Средняя концентрация гемоглобина в эритроците, г/дл 33.0 32.7 33.4
Концентрация гемоглобина, г/дл 9.5 9.3 13.2
Содержание тромбоцитов, 109 кл/л 85 95 163
Лимфоциты, % 23 27 33
Моноциты, % 5 3 4
Базофилы, % 0 0 1
Эозинофилы, % 1 1 2
Палочкоядерные нейтрофилы, % 1 2 1
Сегментоядерные нейтрофилы, % 65 66 59
Объем крови, мл 6.0 6.0 5.0
Объем плазмы, мл 3.6 3.6 3.0
Таким образом видим, что сорбент на основе пептида пригоден для работы с цельной кровью. Для сорбентов 'У и 'ТУ получены аналогичные результаты.
Стерилизация автоклавированием при 121°С не ухудшает сорбционные характеристики ни у одного из полученных в работе сорбентов. Все хроматогра-фические материалы пригодны для хранения без изменения ха
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.