ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 424, № 3, с. 426-429
^ ОБЩАЯ ^^^^^^^^^^^^^^^^
БИОЛОГИЯ
УДК 581:1:632
АКТИН ВОВЛЕКАЕТСЯ В РАННИЕ ОТВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ РАСТЕНИЙ НА ДЕЙСТВИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И АССОЦИИРУЕТ С МОЛЕКУЛЯРНЫМИ ШАПЕРОНАМИ В УСЛОВИЯХ СТРЕССА
© 2009 г. Ä. Л. Куликова, В. П. Холодова, Вл. В. Кузнецов
Представлено академиком H.H. Никольским 28.04.2008 г. Поступило 25.06.2008 г.
Актиновый цитоскелет - высокоорганизованная динамичная сеть актиновых микрофиламен-тов (АФ) и ассоциированных с ними белков - вовлекается в большинство протекающих в клетках процессов жизнедеятельности [1]. Актин в растительных клетках образует различные структуры, способные к взаимным переходам, и присутствует в клетке в виде плотных пучков продольных филаментов, связанных между собой и с клеточной мембраной в единую сеть, а также в виде тонкой примембранной сети полимерного актина и пула мономерного (неполимеризованного) актина. Перестройки клеточного метаболизма зачастую сопровождаются изменениями в организации АФ и в соотношении между его полимерной и мономерной формами.
Тонкая примембранная сеть актина характерна для состояния динамического равновесия между пулом мономерного актина и микрофиламен-тами актина, быстро реагирует на внешние и внутренние воздействия и легко разрушается при действии деполимеризующих агентов [2, 3]. В отличие от тонких сетей актина плотные протяженные пучки АФ скорее вовлекаются в такие фундаментальные, более длительные во времени биологические процессы, как движение цитоплазмы и внутриклеточный везикулярный транспорт.
Актиновый цитоскелет может участвовать в процессах адаптации растений к стрессорным воздействиям, в частности к солям тяжелых металлов, начиная от восприятия и передачи сигнала [4] и заканчивая участием в формировании и функционировании защитных и регуляторных механизмов. Соли тяжелых металлов, повсеместно загрязняющие окружающую среду, оказывают сильное токсическое воздействие на растения, связываясь с БИ-группами белков, что приводит к
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии наук, Москва
изменениям их конформации и биологических свойств, а также участвуя в инициации окислительного стресса [5, 6]. Выживание растений в условиях повреждающего действия солей тяжелых металлов обеспечивается за счет формирования целого спектра клеточных защитных механизмов, среди которых важное значение имеет: 1) новообразование фитохелатинов и металлоти-онеинов, связывающих тяжелые металлы, и тем самым выводящих их из активного клеточного метаболизма; 2) синтез молекулярных шаперо-нов - гомологов БТШ70, БТШ60 и т.п. и 3) формирование и функционирование антиоксидант-ных систем [6, 7].
До настоящего времени проведены лишь немногочисленные исследования по влиянию ТМ на цитоскелет растительных клеток. Так, кадмий вызывал дезорганизацию и разрушение микро-филаментов и микротрубочек зеленой водоросли 8р1го§уга [8], а алюминий - образование плотных пучков актиновых филаментов в меристематиче-ских клетках корня ТгШеиш Ш^ёиш [9]. Установлено также, что устойчивость к алюминию мутантов табака была сопряжена со значительным увеличением общего содержания актина и особенно доли плотных пучков филаментов в клетках листьев [10].
Однако вопрос о вовлечении актинового ци-тоскелета в быстрый стрессорный ответ растений на повреждающее действие ТМ остается открытым. Тем более, не показана ассоциация молекулярных шаперонов (аналогов БТШ) с актиновым цитоскелетом в условиях действия тяжелых металлов, хотя хорошо известно, что БТШ (или их аналоги) являются молекулярными шапе-ронами, участвуют в поддержании нативной структуры белков, предотвращая их денатурацию и агрегацию. Взаимодействие БТШ с актином может иметь ключевое значение для сохранения структуры цитоскелета и выживания растений в условиях действия тяжелых металлов. Задача настоящего исследования состояла в том, чтобы выяснить: 1) вовлекается ли актиновый
(а) твт «мымц.^
«■О 4i
(б)
(в) 1 " " — 1
кДа 43
43
43
1 2 3 4 5
Рис. 1. Влияние сернокислых солей меди и цинка на содержание актина в субклеточных фракциях корней рапса. Представлены иммуноблоты, полученные после проведения электрофореза фракций гомогената корней рапса в 10%-ном ПААГ с ДДС-№ и идентификации актина с помощью анти-актиновых антител. В лунку при электрофорезе вносили по 40 мкг белка каждой фракции. а - осадок 15000 g (сеть, пучки микрофиламентов актина); б - осадок 100000 g (одиночные филаменты актина); в - надосадочная жидкость при центрифугировании при 100000 g (мономерный актин). 1 - контроль, 2 - 25 мкМ Си804, 3 - 50 мкМ Си804, 4 - 250 мкМ 7п804, 5 - 500 мкМ 7п804.
цитоскелет в быстрый стрессорный ответ растений на повреждающее действие ТМ и 2) ассоциируют ли БТШ с актином в условиях стресса. В представленной работе впервые показано, что кратковременное воздействие на растения рапса избытка меди приводит к заметному увеличению количества полимерного актина в клетках корней и к увеличению количества БТШ70 и БТШ60, ассоциированных с филаментами актина.
В качестве объекта исследования использовали растения рапса (Brassica napus L.) сорта Вестар. Семена рапса после поверхностной стерилизации гипохлоритом выращивали на среде Хогланда-Снайдерс в условиях фитотрона при температуре 25°С, относительной влажности воздуха 60% и 16-часовом световом периоде при интенсивности освещения 3.5 клк [11]. Спустя 20 дней, по достижении растениями стадии 3-4 настоящих листьев, в часть сосудов вносили соли меди и цинка до конечных концентраций 25 и 50 мкМ и 250 и 500 мкМ соответственно. Растения находились в условиях действия тяжелых металлов в течение 6 ч, после чего корни отмывали в дистиллированной воде, фиксировали жидким азотом и хранили при -70°С.
Для получения фракций актина образцы корней гомогенизировали в среде следующего состава: 50 мМ Hepes, pH 7.5; 5 мМ MgCl2; 60 мМ KCl; 5 мМ EGTA; 5%-ный меркаптоэтанол; 5 мМ фе-нилметилсульфонил фторид (ФМСФ); ингибитор трипсина (10 мкг/мл) и лейпептин (10 мкг/мл). Для солюбилизации мембран среда содержала 1%-ный тритон Х-100. Гомогенат фильтровали через двойной слой мираклоса и центрифугировали (15 000 g, 30 мин). При этом в осадок выпада-
ли фнламенты актина, объединенные в сеть и связанные с сохранившимися фрагментами клеточной стенки (осадок 1, сеть микрофиламентов). На-досадочную жидкость далее центрифугировали при 100000 g в течение 2 ч. В осадке находились одиночные филаменты актина и связанные с ними белки (осадок 2, одиночные филаменты актина). Эта фракция могла также содержать участки мембран, устойчивые к действию тритона Х-100, так называемые липидные плоты (lipid rafts), возможно, связанные с актиновыми микрофиламента-ми [12]. В надосадочной жидкости оставались растворимые белки, в том числе и неполимеризован-ный актин (фракция 3, мономерный актин). Денатурирующий электрофорез, иммуноблот-тинг и последующее окрашивание продуктов фосфатазной реакции проводили, как описано ранее [13]. Для идентификации актина и БТШ использовали моноклональные антитела против актина фирмы "ICN, clone C4" и поликлональные антитела против БТШ60 и БТШ70 фирмы "Abeam" соответственно.
На рис. 1 представлены фотографии характерных иммуноблотов, отражающие наличие актина в выделенных фракциях гомогенатов корней и влияние на его содержание солей меди и цинка. Как видно из полученных результатов, экспозиция растений в течение 6 ч на среде, содержавшей 50 мкМ CuSO4, в отличие от более низкой концентрации (25 мкМ), вызывала значительное увеличение количества актина во фракции полимеров актина (осадок 100000 g, рис. 16, дорожка 3) и некоторое увеличение его уровня в составе цитоске-летной сети (осадок 15000 g, рис. 1a, дорожка 3).
428
КУЛИКОВА и др.
кДа 70
70
70
1 2 3 4 5
Рис. 2. Идентификация БТШ70 в субклеточных фракциях корней рапса. Представлены иммуноблоты, полученные после проведения электрофореза фракций гомогената корней рапса в 10%-ном ПААГ с ДДС-№ и идентификации БТШ70 с помощью соответствующих антител. Обозначения вариантов те же, что и на рис. 1.
кДа 60
60
60
1 2 3 4 5
Рис. 3. Идентификация БТШ60 в субклеточных фракциях корней рапса. Обозначения те же, что и на рис. 1.
Принимая во внимание тот факт, что количество мономеров актина в растворимой фракции данного варианта (рис. 1в, дорожка 3)не уменьшалось по сравнению с контролем, можно предположить, что растение реагировало на внесение в питательную среду 50 мкМ СиБ04 дополнительным новообразованием актинового белка.
Наблюдаемое нами увеличение количества актина и степени его полимеризации при стрессе может однозначно свидетельствовать о том, что адаптация растений рапса к солям тяжелых металлов сопряжена с быстрыми изменениями актинового цитоскелета. Интересно, что сернокислый цинк в концентрациях, на порядок превышающих используемые в опытах концентрации меди, не оказывал явного влияния на количество и распределение актина по фракциям. Полученные данные согласуются с тем фактом, что соли
цинка оказывают негативное влияние на рост и развитие растений в гораздо больших концентрациях, чем Си [7]. Медь как металл с переходной валентностью является значительно более сильным индуктором генерации активных форм кислорода и состояния окислительного стресса, чем цинк. Это позволяет предполагать, что различия в действии меди и цинка на состояние актинового цитоскелета могут быть опосредованы интенсивностью окислительного стресса, вызываемого в клетках корня различными металлами, а также спецификой клеточного ответа растения на действие Си и 2и.
На рис. 2 и 3 представлены результаты идентификации белков различных фракций гомогената корней, прореагировавших с антителами к БТШ. Как видно из полученных результатов, БТШ70 и БТШ60 присутствовали не только в растворимой фракции,
содержавшей мономерный актин (рис. 2в, 3в), но также в осадках 1 и 2, в которых присутствуют ак-тиновые сети и филаменты актина соответственно (рис. 2а, б и рис. За, б). Наличие БТШ в осадках, полученных в среде с неионным детергентом тритоном Х-100, который выз
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.