НЕЙРОХИМИЯ, 2004, том 21, № 4, с. 250-253
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ РАБОТЫ
УДК 612.8.012
АКТИВАЦИЯ МУСКАРИНОВЫХ АЦЕТИЛХОЛИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ ПЕРВОГО ПОДТИПА УВЕЛИЧИВАЕТ ГЕНЕРАЦИЮ ОКСИДА АЗОТА В СТРИАТУМЕ МОЗГА КРЫС
© 2004 г. В. Г. Башкатова1*, Л. А. Маликова1, О. Г. Алексеева2, В. Д. Микоян3, Г. Праст4, Л. Ф. Панченко2
1 ГУ НИИ фармакологии им. ВВ. Закусова РАМН, Москва 2 ННЦ наркологии МЗ РФ, Москва 3 Институт химической физики РАН, Москва 4 Институт фармакологии и токсикологии, Университет Инсбрука, Австрия
Цель данной работы - изучение возможного участия оксида азота (N0) в механизмах активации му-скариновых ацетилхолиновых рецепторов 1-го подтипа (М1) у крыс линии Спрег-Доули. Генерацию N0 оценивали методом электронного парамагнитного резонанса. Было показано, что после введения агониста М1-рецепторов 4-[^-(3-хлорфенил)карбамоилокси]-2-бутинилтриметиламмо-ний хлорида (Мс^А-343) уровень N0 в мозге крыс был в 2 раза выше, чем у контрольных животных. Предварительное введение ингибиторов N0-синтазы в значительной степени предотвращало усиленную генерацию N0, вызванную агонистом М1-рецепторов, причем наиболее выраженным эффектом обладал ^нитро-Ь-аргинин, неселективный ингибитор этого фермента. Таким образом, результаты наших исследований свидетельствуют, что активация М1-холинорецепторов является N0-зависимым процессом.
Ключевые слова: ацетилхолиновые, мускариновыерецепторы 1-го подтипа, оксид азота, ингибиторы И0-синтазы, нейротоксичностъ
Мускариновые ацетилхолиновые рецепторы относятся к семейству рецепторов, связанных с в-белками и широко распространены в ЦНС [1, 2]. При стимуляции М-холинорецепторов в передаче сигнала важную роль наряду с в-белками играют и вторичные передатчики (цАМФ; цГМФ; 1,2-ди-ацилглицерол и др.). Методами молекулярной биологии были идентифицированы гены для 5 подтипов мускариновых рецепторов М1-5. Показано, что мускариновые ацетилхолиновые рецепторы 1-го подтипа (М1-рецепторы) являются предоми-нантными в коре и гиппокампе головного мозга [3], а вместе с М4-подтипом рассматриваются как главные мускариновые ацетилхолиновые рецепторы стриатума [4, 5]. Известно, что именно М1-холинорецепторы вовлечены в такие процессы, как локомоторная активность, сон, терморегуляция, обучение и память [6-8].
В последние годы была высказана гипотеза, что дисфункция М1-рецепторов в мозге может вносить важный вклад в развитие острых психопатических состояний, связанных с изменением дофаминергической нейропередачи, включая шизофрению [9, 10]. Предполагается, что мускариновые ацетилхолиновые рецепторы выполня-
* Адресат для корреспонденции: 125315 Москва, Балтийская ул., д. 8; факс: (095) 151-12-61; тел. (095) 155-47-53; e-mail: vata@rinet.ru
ют важную роль, осуществляя взаимосвязь между дофаминергической нейропередачей и другими нейротрансмиттерными системами мозга [11, 12]. Однако участие конкретных подтипов мускариновых ацетилхолиновых рецепторов в этих процессах до сих пор остается не достаточно ясным. Изученные свойства М1-рецепторов в прилежащем ядре (nucleus accumbens) позволяют предположить, что холинергическая нейропередача связана с активацией основного фермента, регулирующего синтез оксида азота (КО)-КО-синтазы (NOS), о чем свидетельствуют высокая плотность этих рецепторов и их локализация на нейронах, содержащих NOS [13].
В наших ранее выполненных работах [14, 15] изучено участие холинергической нейропередачи в механизме дофаминергической нейротоксично-сти, обусловленной введением психостимулятора амфетамина, и установлено, что наблюдавшееся в прилежащем ядре мозга крыс усиленное высвобождение этого медиатора является процессом, зависимым от генерации NO. Несмотря на большое внимание исследователей к нейромедиатор-ным функциям NO, его возможное взаимодействие с М1-ацетилхолиновыми рецепторами изучено еще недостаточно. В связи с изложенным выше целью данной работы явилось исследова-
ние участия NO в механизмах активации М-холи-норецеиторов в стриатуме мозга крыс.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксиерименты были выиолнены на 25 крысах-самцах массой 180-220 г линии Сирэг-Доули (Sprague-Dawley), которых содержали ири иосто-янной темиературе и влажности с 12-часовым световым циклом в иитомнике медицинского факультета Университета г. Инсбрука (Австрия). В работе были исиользованы следующие вещества-анализаторы: агонист мускариновых рецеи-торов иервого иодтииа 4-^-(3-хлорфенил)карба-моилокси]-2-бутинилтриметиламмоний хлорид (McN-A-343, Sigma), ингибиторы NO-синтазы: 7-нитроиндазол (7-NI, Sigma), действующий селективно на нейрональную NOS и не обладающий избирательностью N-нитро-Ь-аргинин (L-NNA, Sigma). Оиыты ироводили на животных четырех эксиериментальных груии.
Груииа 1: изотонический раствор (контроль), внутрибрюшинно (в/б), n = 6.
Груииа 2: McN-A-343, 200 мкг, интрацеребро-вентрикулярно (и.ц.в.), n = 7.
Груииа 3: 7-NI, 50 мг/кг, в/б; через 30 мин -McN-A-343, 200 мкг, и.ц.в., n = 6.
Груииа 4: L-NNA, 100 мг/кг; через 30 мин -McN-A-343, 200 мкг, и.ц.в., n = 6.
Для ироведения оиытов с агонистом М1-ре-цеиторов McN-A-343 крысам, наркотизированным уретаном (1.2 г/кг, в/б), билатерально вживляли канюли ио координатам AP -0.8; L +/-1.5; V -4.8 [16].
Дозы ингибиторов NOS были выбраны исходя из данных других авторов и результатов наших иредыдущих исследований [14, 17]. С целью выбора дозы McN-A-343 были ироведены иредвари-тельные эксиерименты в диаиазоне 50-200 мкг, в которых было установлено, что наибольшее усиление высвобождения ацетилхолина в ирилежа-щем ядре крыс Сирег-Доули наблюдалось иосле введения дозы 200 мкг [18].
Для оиределения содержания NO в стриатуме мозга исиользовали ирямой количественный метод [19] электронного иарамагнитного резонанса (ЭПР) [19], иозволяющий оценивать генерацию NO в мозге крыс ио включению иоследнего в комилексы с двухвалентным железом и диэтил-дитиокарбаматом (ДЭТК), в результате чего образуются иарамагнитные мононитрозильные комилексы железа с ДЭТК (МНКЖ-ДЭТК). Эти комилексы характеризуются сигналом ЭПР с g-фактором, равным 2.035 и 2.0. Для образования в организме МНКЖ-ДЭТК крысам одновременно вводили водный раствор Na-ДЭТК (Sigma) в дозе 500 мг/кг в/б и смесь растворов FeSO4 ■ 7Н2О в дозе 37.5 мг/кг и цитрата натрия в дозе 187.5 мг/кг
подкожно. Через 30 мин после введения указанных веществ крыс декапитировали, немедленно на холоду извлекали головной мозг, стриатум помещали в специальные стеклянные трубочки и замораживали для последующего ЭПР-анали-за. Регистрацию сигнала ЭПР образцов проводили на радиоспектрометре "Radiopan" (Польша). Статистическую обработку результатов проводили с использованием рангового теста Вилкоксона.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В результате наших экспериментов установлено, что у контрольных животных уровень NO в стриатуме мозга крыс составлял 2.41 ± 0.3 нмоль/г (рис 1). У животных группы 2 после введения аго-ниста М1-холинорецепторов McN-A-343 генерация NO значительно возрастала и достигала значений 3.98 ± 0.43 нмоль/г. Предварительное введение ингибиторов NOS значительно ослабляло этот процесс и концентрация NO у крыс как 3-й, так и 4-й групп была достоверно ниже, чем у животных 2-й группы, которым вводили только агонист М1-рецепторов. Следует отметить, что уровень NO в стриатуме крыс при применении L-NNA в дозе 100 мг/кг за 30 мин до инъекции McN-A-343 (группа 4) не отличался от аналогичного показателя животных, получавших только физиологический раствор (группа 1), т.е. неселективный ингибитор NOS полностью предупреждал увеличение содержания NO, обусловленное активацией М1-рецепторов (рисунок).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В нашей работе было впервые обнаружено усиление генерации NO в стриатуме крыс линии Спрег-Доули в ответ на стимулирование мускариновых ацетилхолиновых рецепторов 1-го подтипа их селективным агонистом McN-A-343. Сходные данные были получены другими исследователями, наблюдавшими увелечение экспрессии индуцибильной и нейрональной NOS при стимуляции M1-рецепторов карбохолом [20]. Эти результаты могут быть объяснены или ускорением синтеза NO и/или снижением скорости его метаболизма и высвобождения. Поскольку предварительное введение ингибиторов NO-синтазы значительно ослабляло способность McN-A-343 увеличивать содержание NO в стриатуме, эти данные позволяют сделать вывод об активирующем влиянии изучавшегося агониста M1-рецепторов на систему синтеза NO.
Допустимо предположить, что наблюдаемое в наших опытах через 30 мин после введения агониста McN-A-343 увеличение генерации NO обусловлено активацией конститутивных NO-синтаз, так как установлено, что для активации индуци-
252
БАШКАТОВА и др.
ж ж ж
Влияние агониста М1-рецепторов МсК-А-343 и ингибиторов К0-синтазы 7-нитроиндазола и К-нитро-Ь-аргинина на генерацию оксида азота (N0) в стриату-ме мозга крыс линии Спрег-Доули. По оси ординат: концентрация оксида азота (N0), нмоль/г.;
по оси абсцисс: 1 - контроль (физиологический раствор, в/б) п = 6, 24.1 ± 0.3; 2- Мс^А-343 (200 мкг, билатерально в желудочки мозга) п = 7, 3.98 ± 0.43; 3 -7-нитроиндазол (7-№, 50 мг/кг, в/б); через 30 мин Мс^А-343 (200 мкг, билатерально в желудочки мозга) п = 6, 3.00 ± 0.31; 4 - М-нитро-Ь-аргинина (Ь-ША, 100 мг/кг, в/б); через 30 мин Мс^А-343 (200 мкг, билатерально в желудочки мозга.) п = 6, 2.38 ± 0.45. М ± Б.Е.М; *р < 0.05 - отличие по сравнению с контролем; #р < 0.05 -отличие по сравнению с группой 2.
бельная изоформы фермента требуется гораздо более длительное время - порядка нескольких часов [21]. К конститутивному типу NOS, способному активироваться за гораздо более короткое время, относятся две формы этого фермента - эн-дотелиальная и нейрональная, активация которых зависит от присутствия ионов Ca++ [22]. Принимая во внимание наши результаты, показывающие, что эффект 7-NI, ингибирущего активность только нейрональной NO-синтазы, был менее выражен по сравнению с таковым у неселективного ингибитора NOS, можно предположить, что не только нейрональная, но и эндотелиальная изоформы этого фермента играют важную роль в процессе образования NO в ответ на введение агониста М1-холинорецепторов.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.