ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 463, № 4, с. 496-499
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.22
АКТИВАЦИЯ СОРБЦИИ БАКТЕРИЙ Staphylococcus epidermidis 33 НА ГИДРОФОБНОЙ ПОВЕРХНОСТИ ПОЛИСТИРОЛА АУТОГЕННЫМИ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ ФАКТОРАМИ © 2015 г. В. П. Коробов, Д. В. Ерошенко, К. C. Лауринавичюс
Представлено академиком РАН В.А. Черешневым 22.12.2014 г. Поступило 26.02.2015 г.
В работе представлены результаты исследования соединений, выделяемых в среду во время адгезии бактерий S. epidermidis к различным по уровню гидрофобности поверхностям. Эти соединения, по-видимому, имеют пептидную структуру, обладают мол. массой 550—600 Да и проявляют способность стимулировать адгезию бактерий исследованного штамма, выполняя, по существу, функцию кворум-факторов процесса бактериальной адгезии.
Б01: 10.7868/80869565215220284
Стремительный рост исследований, направленных на изучение механизмов формирования биопленок бактериальных клеток на поверхностях раздела фаз, обусловлен осознанием выдающейся роли этих структур в функционировании и персистенции микроорганизмов в окружающей среде [1]. Исследованиями последних лет накоплен значительный объем сведений, свидетельствующий о наличии систем координированного поведения сообществ бактериальных клеток при освоении ими конкретных зон обитания [2]. Оккупация поверхностей бактериями является одним из этапов преодоления ими границы раздела фаз [3]. Этот процесс может быть во многом связан с направленным синтезом бактериальными клетками соединений, оптимизирующих и ускоряющих этот процесс. С другой стороны, адгезия во многом определяется неспецифическими физико-химическими свойствами обеих взаимодействующих сторон, а также окружающей среды [4].
Известно, что добавление пептидов, состоящих из 8 аминокислотных остатков, имеющих в
Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской Академии наук, Пермь
E-mail: dasha.eroshenko@gmail.com
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им. Г.К. Скрябина
Российской Академии наук, Пущино Московской обл. Пермский государственный национальный исследовательский университет Пермский национальный исследовательский политехнический университет
своем составе тиолактоновое кольцо и известных как феромоны бактерий вида S. epidermidis, к бактериям другого вида — S. aureus — способно снижать прикрепление клеток последних к полистиролу за счет управления системой agr (accessory gene regulator), входящей в систему чувства кворума ("Quorum sensing") [5].
В настоящей работе проведено изучение влияния на адгезию и образование бактериальных пленок соединений, продуцируемых во внешнюю среду атакующими поверхность полистирола бактериями S. epidermidis 33 в процессе адгезии и первых этапов роста их биопленок.
В качестве объекта исследований использовали штамм бактерий S. epidermidis GISK 33 (Государственная коллекция патогенных микроорганизмов, ГКПМ, ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" МЗ России). Для изучения возможного появления в адгезионной среде соединений, способных усиливать или подавлять сорбцию бактерий, применяли фильтраты иннокулированной бактериями среды, полученные при разных периодах процесса адгезии бактерий S. epidermidis. Для этого через 0, 30, 60, 120 и 240 мин культивирования бактерий в среде LB при 37°C без перемешивания жидкую часть культур с поверхности полистироловой чашки Петри ("Медполимер", Россия) отбирали аспирацией, и планктонные клетки осаждали центрифугированием (12000 об./мин, 5 мин, 4°С). Полученные супернатанты подвергали стерилизующей фильтрации с помощью мембранных фильтров (диаметр пор 0.20 мкм). Фильтраты в дальнейшем использовали в качестве среды для последующей адгезии и образования биопленок бактериями
того же инокулума, термостатированного при 4°С.
Изучение адгезионных свойств бактерий так же проводили в полистироловых чашках Петри ("Медполимер") при 37°С без перемешивания, но в течение лишь 30 мин. После удаления планктонных клеток численность сорбированных на поверхности полистирола бактерий оценивали прямым подсчетом после окрашивания 0.1% раствором генцианвиолета. Биопленки выращивали в ячейках 96-луночного планшета ("Медполимер") с последующим удалением планктонных клеток, окрашиванием биопленок генцианвиоле-том, экстракцией красителя 96%-м этанолом и измерением оптической плотности полученного раствора красителя при 570 нм [6]. Статистический анализ данных проводили с использованием метода АЫО\А. Данные представляли в виде М ± 8Б трех независимых экспериментов. Различия оценивали как достоверные прир < 0.05
Согласно результатам, представленным в табл. 1, использование фильтратов сред, полученных в разные периоды времени роста прикрепленной популяции, в качестве инкубационной среды роста "свежих" бактериальных клеток позволило выявить изменение интенсивности адгезии бактерий. При этом увеличение численности связанных с поверхностью "свежих" бактериальных клеток достигало 31—37% при инкубировании их в фильтратах среды, полученных в течение первых 30—120 мин инкубации бактерий этого же инокулума.
Для подтверждения механизмов подобного действия неизвестных химических факторов фильтратов, которые не могли быть обусловлены истощением питательных компонентов среды культивирования на начальных сроках роста бактериальной популяции, дальнейшие эксперименты проводили по указанной выше схеме, но питательная среда была заменена на 10 мМ фос-фатно-солевой буфер (рН 7.2). Для оценки роли физико-химических свойств атакуемой поверхности эксперименты проводили на поверхностях полистирола и стекла.
Результаты этой серии опытов представлены на рис. 1. Как видно из рисунка, стимулирующее влияние на адгезию фильтратов, полученных после сорбции клеток бактерий 8. epidermidis 33 на поверхность полистирола, проявляется только через 60 мин взаимодействия бактериальной культуры с поверхностью. При этом фильтраты, полученные после контакта бактерий с поверхностью стекла, практически не влияли на адгезию бактерий.
Анализ фильтратов с помощью метода MALDI-TOF подтвердил предположение, что инкубация клеток 8. epidermidis 33 в фосфатно-солевом буфере (ФБ) в процессе адгезии к разным типам поверхностей сопровождается выделением в среду
Количество клеток/поле зрения
Фильтрат среды после контакта бактерий с полистиролом
Фильтрат среды после контакта бактерий со стеклом
Рис. 1. Адгезия бактерий 8. epidermidis 33 на поверхности полистирола в фильтратах, полученных после адгезии бактерий того же штамма в ФБ на поверхности полистирола или стекла в течение 30 или 60 мин. Здесь и на рис. 3 М± 8Б (п = 9) и *р < 0.05 по сравнению с контролем.
некоторых соединений (рис. 2). Так, при адгезии как на гидрофильной, так и на гидрофобной поверхности клетки выделяют в среду низкомолекулярные соединения с массой от 264 до 684 Да. Важно отметить, что на гидрофобной поверхности полистирола, наиболее благоприятной для адгезии клеток стафилококков по сравнению с гидрофильной поверхностью стекла, содержание этих соединений в среде было практически в 2 ра-
Таблица 1. Адгезия (30 мин) и образование биопленок (24 ч) бактериями 8. epidermidis 33 в фильтратах среды, полученных в разные интервалы времени на первых этапах образования биопленок бактериями штамма 8. epidermidis 33
Время отбора среды для получения фильтрата, мин Адгезия, количество клеток в поле зрения Биопленка, ОВ570
Свежая среда 49 ± 7 0.19 ± 0.02
0 49 ± 12 0.17 ± 0.03
30 64 ± 13* 0.20 ± 0.02
60 67 ± 10* 0.20 ± 0.05
120 62 ± 7* 0.16 ± 0.01
240 44 ± 15 0.19 ± 0.03
ОВ — оптическая плотность; * р < 0.05 по сравнению с контролем ("свежая среда").
498
КОРОБОВ и др.
Рис. 2. Масс-спектры фильтратов ФБ с бактериями S. epidermidis 33, полученных после адгезии бактерий на поверхность полистирола и стекла в течение 30 и 60 мин. 1 — фильтрат после адгезии на стекле в течение 30 мин, 2 — фильтрат после адгезии на полистироле в течение 30 мин, 3 — фильтрат после адгезии на стекле в течение 60 мин, 4 — фильтрат после адгезии на полистироле в течение 60 мин.
за больше (рис. 2). С увеличением времени инкубации содержание всех соединений в основном увеличивалось, независимо от типа поверхности. Кроме того, мы обнаружили ещё три соединения
Количество клеток/поле зрения, % от контроля 200
150
100
50
Контроль
Фильтрат без обработки
Фильтрат + трипсин
Фильтрат + протеиназа K
Рис. 3. Адгезия бактерий S. epidermidis 33 на поверхности полистирола в фильтратах, полученных после адгезии в ФБ бактерий того же штамма на поверхности полистирола в течение 60 мин и обработанных трипсином или протеиназой K.
с молекулярной массой 552, 574 и 596 Да. Это послужило основанием для предположения, что эти соединения, возможно, являются "агентами кворума", способными оказывать влияние на процессы бактериальной адгезии.
В связи с тем, что регуляторными молекулами систем "Quorum sensing" у бактерий рода Staphylococcus выступают короткие пептиды [5], мы предположили, что обнаруженные соединения также могут относиться к группе пептидных молекул. Для этого бесклеточные фильтраты, полученные после контакта бактерий с поверхностью полистирола в течение 60 мин, были обработаны растворами протеаз (трипсин или протеиназа K производства "Sigma", США) в концентрации 100 мкг/мл при 37 °C в течение 2 ч с последующим отделением ферментов с помощью фильтрования через мембрану (10 кДа). В контрольные пробы вносили 10 мМ трис-НС1-буфера (pH 7.2). Результаты этих экспериментов показали, что обработка фильтратов протеолитическими ферментами снижает стимулирующее действие этих соединений на адгезию S. epidermidis 33 до уровня, сходного с контрольным (рис. 3). Эти данные указывают на наличие пептидных связей в исследуемых соединениях.
0
Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о возможности функционирования процессов ауторегуляции адгезионных процессов при освоении бактериальной популяцией свободных поверхностей на границах раздела фаз. В результате экспериментов мы обнаружили, что начальные периоды колонизации поверхности полистирола бактериями S.epidermidis сопр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.